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铁皮石斛转录组分析与其在鉴定多糖合成相关基因中的应用

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研究背景
•铁皮石斛是兰科 (Orchidaceae)植物中著名的药用植物,数百年来被用于退烧、明目,有免疫功能调节的功效。
•霍山产铁皮石斛(D. officinale)的茎部富含葡萄糖和甘露糖等多糖,这些多糖凭借其抗氧化、免疫刺激和抗肿瘤的功能已被证明是重要的生物活性物质。然而,参与铁皮石斛多糖合成与代谢通路的编码基因仍所知甚少,并且迄今只有一种石斛兰科植物基因组已知,相关基因组信息十分有限。


研究目的
•通过构建幼年和成年两个铁皮石斛转录组参考序列数据库,比较差异基因,找出与次生代谢物多糖合成相关的基因。

研究样品:
华南植物园温室培育霍山产铁皮石斛

文章脉络

1.测序组装与注释
1.1测序组装结果统计
  幼年组A:将1.02亿条reads组装成107,086条contigs,拼接成93,881 条unigenes
  成年组B:将0.86亿条reads组装成129,235条contigs,拼接成114,098 条unigenes
    
1.2 COG功能分析
比对COG database后,25,982条unigenes被分为25个功能分类,
其中最显著的是General function prediction only,有7861条 unigenes (30%)匹配。

1.3 Unigene的GO分析结果统计
GO分析结果表明大多数基因都和生物代谢通路相关。

1.3 Unigene的KEGG代谢通路结果分析
两组共得到的unigenes中有17,281条比对到KEGG数据库,其中135条注释到果糖甘露糖代谢通路。
果糖和甘露糖也是该植物中主要合成的多糖。转移酶是否在这些通路里。


果糖和甘露糖具体代谢通路

2.目标基因的寻找与筛选
所有Unigenes对比CAZy数据库进行BLASTX分析后发现目的基因:
糖基转移酶
糖基转移酶相关基因430条,分别归属于35个GT家族 。其中糖基转移酶GT39只存在于霍山产铁皮石斛中。

纤维素转移酶
纤维素转移酶相关基因405条,属于霍山产铁皮石斛CesA大家族的89条并挑选19条unigenes画出系统进化分析树发现它们分别归属6个CesA家族的。

2.1差异基因筛选
为寻找两个发育阶段的差异基因,比对幼年株和成年株两个数据库,共得到32,794条差异基因。


相对幼年株,成年株中有22051条上调DEGs;                       两个数据库中有27.97%为DEGs,10743条下调DEGs

找出了这些代谢通路及次生代谢物合成主要相关的差异基因,再对它们进行后续分析。

2.2 目标基因及转录因子相关的差异基因筛选
找出两组数据库比对出的DEGs中,与糖基转移酶和纤维素转移酶相关的基因进行比对分析

糖基转移酶


170个GTs在幼株和成年株中差异表达数最多
 

纤维素转移酶


差异表达基因的Csls家族分类


差异表达基因的GTs家族分类

2.2 转录因子相关的差异基因筛选
转录因子TF被认为是重要的介导次级代谢通路的因子。
在铁皮石斛幼年和成年转录组中比对出的627个TFs都与多糖合成代谢相关。以转录因子MYB为例,相对幼年株,成年株中上调的35个转录因子有可能与次代谢调控相关;下调的47个转录因子则有可能与细胞壁形成等形态学调控相关。

3 关键酶基因表达量的验证
18个GT合成相关的编码基因被随机挑选用qRT-PCR方法验证其在幼年株和成年株中表达量的变化。

结果与测序结果一致,各基因在幼年和成年阶段的铁皮石斛中均存在差异表达,再次验证这些基因参与次生代谢无多糖的合成代谢调解。


结  果
1.  构建幼年和成年两个铁皮石斛转录组参考序列数据库;
2.  鉴定出大量与糖基转移酶、纤维素转移酶合成代谢通路相关的基因;
3. 比较幼年和成年株的铁皮石斛中与多糖合成代谢相关的差异基因,发现是由GT家族、TF家族中的多种基因共同参与调解其次生代谢通路。

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