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玉米转录因子导入拟南芥研究镉离子胁迫耐受机制

合作老师:华南植物园 贺立龙

文章下载链接:http://www.genedenovo.com/uploads/tmp/genedenovo-resume-1467363955.1458149.pdf

基迪奥新文章,研究玉米转录因子在拟南芥镉离子胁迫耐受中的调控机制。发表在Plant Physiology杂志上,IF 6.84。

研究背景

镉离子是土壤重金属污染的其中一种,会影响植物生长,并且长期慢性摄入镉离子会造成很多健康问题,如癌症、心血管疾病等。因此,研究农作物对镉离子胁迫的耐受机制,有助于我们进行作物改良。
之前有报道指出,氧化应激蛋白(oxidative stress 2,OXS2)在拟南芥压力应激和压力逃避方面发挥重要作用。其中,在压力逃避方面,OXS2通过激活下游一些开花基因如SOC1,从而促进植物繁殖、保证植物生存。但OXS2是如何激活压力耐受信号通路却不清楚。
由于本文作者主要是想研究玉米这种经济作物,因此选择转基因的方法,在模式生物拟南芥中研究与鉴定OXS2激活下游信号通路的靶基因。

文章总体研究思路

研究结果
1. Blast比对预测拟南芥OXS2基因在玉米中的两个同源基因
结果:找到了两个同源基因:ZmOXS2b和ZmO2L1,并且这两个基因在镉离子处理下的玉米中表达量上调了2-3倍,说明这两个同源基因可响应镉离子胁迫。

2. 将玉米同源基因导入拟南芥中,并检测其对镉离子的耐受性
将ZmOXS2b和ZmO2L1转基因导入野生型拟南芥和oxs2-1、o2l1-1突变体中,并检测四株转基因拟南芥对镉离子的耐受性。结果发现,导入玉米同源基因后,拟南芥对高浓度镉离子的耐受性增强,与非转基因植株相比,根生长更长、嫩芽生长更快。

                                 

3. RNA-seq检测差异表达基因
然后利用RNA-seq,检测转基因拟南芥和非转基因拟南芥在镉离子胁迫下基因表达的差异变化。差异表达分析结果显示,共有30个差异表达基因在ZmOXS2b与ZmO2L1转基因植株共有(维恩图交集部分),这些基因在两种转基因植株中表达模式相似(图B)。其中14个基因与应激、金属离子运输相关。


备注:作者给这30个DEG从1-30命名了。

4. qPCR验证RNA-seq结果
对这30个共有DEG进行qPCR验证,其中8个DEG与非转基因植株相比,基因表达量变化最大(3.6~13.9倍)(上图 C)。这8个DEG甚至在没有镉处理的情况下也会在转基因植株中表达上调。
这8个DEG分别是:DEG7,DEG11,DEG19,DEG20,DEG21,DEG23,DEG24,DEG30

5. 体内体外实验验证ZmOXS2b和ZmO2L1激活DEG启动子上的转录因子结合位点BOXS2 motif

得到了转入玉米基因后表达量上调的基因后,那么下一步就要研究这两个玉米OXS2基因是怎样与拟南芥的靶向基因相互作用的。之前有报道指出,AtOXS2可通过结合一段富含CT的9bp长的motif来激活启动子,这段motif称为BOXS2。那么,我们可以猜测,玉米OXS2基因可能也是通过转录因子结合的方法,激活下游靶向基因的表达的。因此,对上一步得到的8个DEG进行转录因子结合位点计算机预测,发现DEG11,DEG21,DEG23的启动子区都含有潜在的BOXS2转录因子结合序列。然后作者通过体外荧光素酶报告基因实验和体内ChIP-qPCR实验,来验证计算机预测的结果,验证ZmOXS2b和ZmO2L1是否是通过结合BOXS2 motif来激活启动子的。

体外荧光素酶报告基因实验:将8个DEG的启动子与荧光素酶报告基因融合(图A)

体内ChIP-qPCR实验:拟南芥中导入含有FLAG标签的ZmOXS2b和ZmO2L1,然后用FLAG抗体共沉淀,并qPCR验证DNA表达量(图B)

结果:体外实验和体内实验的结果都发现,只有这三个含有BOXS2  motif的DEG的结果为阳性,说明ZmOXS2b和ZmO2L1是通过转录因子的方式,结合BOXS2元件,从而激活下游靶向基因的启动子。这结果也说明实验验证的结果与计算机预测的结果高度一致。

6. 过表达8个DEG检验能否增强拟南芥对镉离子的耐受性
然后作者构建了这8个DEG的过表达载体,转入拟南芥中过表达这些基因,发现只有DEG23能够增强拟南芥对镉离子的耐受性,并且只过表达DEG23已经能够增强拟南芥对镉离子的耐受性了,说明这个基因在缓解镉离子毒性中起着很重要的作用。
DEG23编码一个甲基化转移酶,因此被命名为CIMT1。(在CIMT1过表达系,CIMT1表达量上调了14-17倍) 

7.验证ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子的
秉着严谨的科学态度,作者又在目标基因CIMT1启动子上设计了四对引物(如下图), 进行ChIP-qPCR来检验ZmOXS2b和ZmO2L1是否通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子。

结果:
只有包含了BOXS2 motif(图中黑色部分)的F12和F20引物对的ChIP-qPCR结果是阳性的,说明ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活启动子,并且这种作用并不依赖于镉离子(也做了不加镉的处理,结果同样是阳性)。

总结:
其实这两个玉米氧化应激蛋白,就是转录因子,文章通过将这两个同源基因导入拟南芥,在模式生物中研究这两个转录因子的下游靶向基因,通过计算机预测、体内体外实验,逐步缩小范围,最终找到了一个靶标基因CIMT1,这个基因启动子上的BOXS2 motif可以结合玉米转录因子,从而被激活表达,缓解镉离子对植株的毒性。

展望:
其实玉米才是这个实验室的目标研究作物。这篇文章找到拟南芥CIMT1基因后,作者展望了可以通过找出CIMT1在玉米中的同源基因,然后研究这个同源基因能否在玉米镉离子胁迫中也发挥相似的作用。

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