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CHIP-SEQ助力脱髓鞘分子机制研究

发表期刊:《The Journal of Neuroscience》    IF:5.924

文章下载链接:
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研究思路
总的来说,这篇文章的思路是这样的:

研究背景和目的
脱髓鞘疾病,包括多发性硬化,是由髓鞘急性或慢性损伤、髓鞘再生不足引起的,目前其发病的具体分子机制还不清楚。髓鞘由少突胶质细胞组成,少突胶质细胞的损伤导致了脱髓鞘疾病,并且由于少突胶质细胞前体细胞(OPC)不能增殖成熟,导致髓鞘不能再生。目前的免疫疗法对脱髓鞘的治疗效果非常有限,因此需要其他更有效的治疗手段来促进髓鞘再生。

Gpr17是一个7次跨膜G蛋白偶联受体,之前的报道指出Gpr17信号通路的激活上调了分化抑制因子ID2的表达,在少突胶质细胞系中过表达Gpr17能损害髓鞘生成,而Gpr17敲除小鼠则过早表现出髓鞘形成。因此,本文通过ChIP-seq实验、体外生化实验和体内突变实验,阐明Gpr17在溶血卵磷脂(LPC)诱导的脱髓鞘损伤中的作用机制,为临床治疗提供潜在的药物靶点。


实验材料
溶血卵磷脂(LPC)处理的大鼠少突胶质细胞,和未处理细胞。

研究结果
1、ChIP-seq鉴定细胞中的转录活跃基因
文章首先对LPC处理的少突胶质细胞和未处理对照细胞进行H3K27Ac的ChIP-seq测序,寻找全基因组范围内转录活跃的区域和基因。


为什么要做H3K27Ac的ChIP-seq?
一般来说,转录活跃基因的转录起始位点都被H3K27Ac和H3K4me3修饰,而活跃的增强子可通过检测H3K27Ac和H3K4me1的富集情况得到鉴定。因此本文利用H3K27Ac的ChIP-seq来在全基因组范围内寻找转录活跃的区域和基因。
结果发现在差异组蛋白峰相关的基因中,有20多个转录因子,包括Olig2,Gmeb2,Psip1,Smad7,Klf6,和Nab1(图1 E)。其中Olig2编码了一个bHLH转录因子,之前已有报道该转录因子在少突胶质细胞的分化中有着重要作用。qRT-PCR证明,Olig2基因的表达量在LPC处理细胞中显著上调(图1 G)。


图1 差异组蛋白峰相关基因(E);Olig2基因的qRT-PCR实验结果(G)

然后进行Olig2的CHIP-seq实验寻找Olig2的下游靶基因。通过分析差异peak相关基因,找到了Gpr17这个跨膜蛋白基因,并且发现Olig2峰和H3K27Ac峰在Gpr17基因的外显子区overlap(图2)。这些结果表明了Gpr17是Olig2的下游靶基因,可在LPC处理的少突胶质细胞中转录激活。


图2 Olig2CHIP-seq实验鉴定Gpr17

2、Gpr17的功能验证
得到Gpr17这个候选基因后,就要从多个方面验证Gpr17在脱髓鞘中的作用了。利用体外慢病毒shRNA转染实验沉默Gpr17的表达后,Gpr17拮抗剂pranlukast对细胞生存的保护作用被削弱了;另一方面,过表达Gpr17通过诱导细胞凋亡降低了少突胶质细胞的存活,并且Gpr17诱导的细胞凋亡是通过一个促凋亡基因Xaf1来实现的。这些结果表明了Gpr17能够诱导少突胶质细胞的凋亡(图3)。


图3 Gpr17通过Xaf1调控少突胶质细胞的生存

3、Gpr17信号通路研究
进一步通过体内体外实验来研究Gpr17调控Xaf1的分子机制,结果表明,LPC刺激激活了Gpr17基因的表达,引起细胞内cAMP浓度的下降,抑制了PKA信号通路的激活,从而抑制了c-Fos原癌基因的表达、促进了Xaf1促凋亡基因的表达,最后导致了少突胶质细胞的凋亡(图4)。


图4 Gpr17通过cAMP和PKA信号通路调控Xaf1的表达和少突胶质细胞的细胞凋亡

Gpr17除了能够诱导少突胶质细胞的凋亡,还能够抑制少突胶质细胞前体细胞(OPC)的分化与成熟,这是通过抑制Epac1基因的表达来实现的。这些结果也是通过严谨的体内体外实验得到的(图5)。


图5 Gpr17通过抑制Epac1基因的表达来抑制少突胶质细胞的分化

4、体内功能验证
最后,作者利用基因敲除小鼠研究Gpr17在脱髓鞘中的作用。发现敲除Gpr17能够引起髓鞘再生;用Gpr17抑制剂pranlukast处理脱髓鞘小鼠,发现髓鞘再生(图6)。以上这些结果表明了Gpr17可以作为一个潜在的临床治疗的药物靶标。


图6 抑制Gpr17促进了髓鞘再生

结  论
1、LPC处理少突胶质细胞激活了Gpr17基因的表达,引起细胞内cAMP浓度的下降,抑制了PKA信号通路的激活,从而抑制了c-Fos原癌基因的表达、促进了Xaf1促凋亡基因的表达,最后导致了少突胶质细胞的凋亡;
2、Gpr17通过抑制Epac1基因的表达,从而抑制了少突胶质细胞前体细胞的分化与成熟;
3、利用Gpr17拮抗剂pranlukast可以减缓少突胶质细胞的凋亡,促进髓鞘再生。


总  结
又是一篇论证严密的医学类功能验证文章,从候选基因筛选、基因功能验证、作用机制研究、到最后的体内功能验证,一步都不缺,并且每一步都是结合体内体外实验多方面验证,论据充分、论证严密,是这篇文章能够发表5.9分的原因。

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