基于高通量测序的植物抗逆研究方案

●植物抗逆相关项目经验
基迪奥在过去两年内已完成约400个植物抗逆抗病项目，项目金额占比达19.2%，涉及物种覆盖模式植物、作物、林木、中草药等，项目经验丰富，专业服务有保障！

●植物抗逆全方位研究策略

●部分已发表植物学相关文章
1、Ling HQ, et al. (2013) Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu. Nature 496(7443):87-90.
2、Jia J, et al. (2013) Aegilops tauschii draft genome sequence reveals a gene repertoire for wheat adaptation. Nature 496(7443):91-95.
3、He N, et al. (2013) Draft genome sequence of the mulberry tree Morus notabilis. Nature communications 4:2445.
4、Qin C, et al. (2014) Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization. PNAS 111(14):5135-5140.
5、Gao ZY, et al. (2013) Dissecting yield-associated loci in super hybrid rice by resequencing recombinant inbred lines and improving parental genome sequences. PNAS 110(35):14492-14497.
6、Xu W, Dai M, Li F, & Liu A (2014) Genomic imprinting, methylation and parent-of-origin effects in reciprocal hybrid endosperm of castor bean. Nucleic acids research 42(11):6987-6998.
7、Xu W, Yang T, Dong X, Li D-z, & Liu A (2016) Genomic DNA methylation analyses reveal the distinct profiles in castor bean seeds with persistent endosperms. Plant Physiology:pp.00056.02016.
8、He L, et al. (2016) Maize OXIDATIVE STRESS 2 homologs enhance cadmium tolerance in Arabidopsis through activation of a putative SAM-dependent methyltransferase gene. Plant Physiol.
9、Guo J, et al. (2017) Proteomes and Ubiquitylomes Analysis Reveals the Involvement of Ubiquitination in Protein Degradation in Petunias. Plant Physiol 173(1):668-687.
10、Zhang H, Zeng R, Chen D, & Liu J (2016) A pivotal role of vacuolar H(+)-ATPase in regulation of lipid production in Phaeodactylum tricornutum. Scientific reports 6:31319.
11、Zhou Q, et al. (2016) Comparative Transcriptome Analysis between Low- and High-Cadmium-Accumulating Genotypes of Pakchoi (Brassica chinensis L.) in Response to Cadmium Stress. Environmental science & technology 50(12):6485-6494.
12、Yu C, et al. (2017) Integrated analysis of transcriptome and metabolites reveals an essential role of metabolic flux in starch accumulation under nitrogen starvation in duckweed. Biotechnology for biofuels 10:167.
13、Li Y, Fei X, Wu X, & Deng X (2017) Iron deficiency response gene Femu2 plays a positive role in protecting Chlamydomonas reinhardtii against salt stress. Biochimica et biophysica acta 1861(1 Pt A):3345-3354.
14、Liu X, et al. (2017) Transcriptome Changes Associated with Boron Deficiency in Leaves of Two Citrus Scion-Rootstock Combinations. Frontiers in plant science 8:317.
15、Guo P, et al. (2017) Root Adaptive Responses to Aluminum-Treatment Revealed by RNA-Seq in Two Citrus Species With Different Aluminum-Tolerance. Frontiers in plant science 8:330.
16、Zhang J, et al. (2016) Transcriptome Analysis of Dendrobium officinale and its Application to the Identification of Genes Associated with Polysaccharide Synthesis. Frontiers in plant science 7:5.

●基于基因组测序的植物抗逆基因定位解决方案
在经典遗传学理论中，DNA突变是性状差异的基础。因此，抗逆相关基因的定位是植物逆境胁迫研究的重要基础。基迪奥将根据客户的材料特性、研究目的和经费预算，提供定制化的基因定位解决方案，加速功能基因挖掘。

案  例  解  读

案例一：利用MutMap技术快速培育出水稻耐盐新品种^[1]
为应对日本2011年地震和海啸引起的大面积稻田被海水淹没而造成的盐污染问题，研究者利用MutMap技术，鉴定出与水稻耐盐性状相关的基因OsRR22，该基因中的一个无义突变导致了水稻产生耐盐性。将耐盐突变体hst1与野生型亲本Hitomebore杂交，在短短两年时间内培育出了耐盐品种“Kaijin”，该品种保持了亲本优良的产量性状和品质性状，同时具有耐盐性，并在2015年在当地推广。

图1 利用MutMap技术，鉴定出水稻6号染色体上OsRR22基因上的一个无义突变导致突变体hst1产生耐盐性。

案例二：利用GBS和selective genotyping技术定位西瓜抗镰刀菌枯萎病QTL^[2]
本研究利用selective genotyping方法，对30株、32株、29株F2代（其子代F3代分别表现为极端抗病、极端感病、中等抗病）共91株西瓜进行GBS高通量测序，开发SNP分子标记，并构建遗传图谱和进行QTL定位。获得一个和抗镰刀菌枯萎病相关的主效QTL“Fo-1.1”，该QTL位于1号染色体上，解释表型的59.9%。另外也获得一些微效QTL，分别位于1号、3号、4号、9号和10号染色体上。

图2  1号染色体上的遗传图谱和抗镰刀菌枯萎病相关的主效QTL

●基于RNA测序的植物抗逆调控机制解决方案
与基因组DNA相比，由基因转录得到的转录本RNA呈现出时空、组织特异性，更能反映植物在各种逆境胁迫和病原菌入侵时的基因表达变化和基因调控变化。因此，基于RNA-seq的基因表达调控机制研究是植物逆境胁迫研究的最常用方法。基迪奥将根据客户的实验设计，提供最优的分析解决方案，挖掘核心抗逆功能基因。

案  例  解  读

案例一：不同品系小白菜镉胁迫转录组比较分析^[3]
为了研究不同品系小白菜对土壤中重金属镉（Cd）的吸收及累积差异的分子机制，对LAJK（低镉累积品系）和HAJS（高镉累积品系）进行镉处理，分别取两个品系处理0h，3h和24h后的各三个根系样本进行转录组测序。通过对品系内不同时间点的差异基因进行趋势分析、对同一处理时间点的两品系间进行差异比较，发现HAJS对Cd胁迫的应激反应更迅速，并且发现LAJK中大量表达参与Cd排放的基因PDR8；而HAJS中负责Cd转运（吸收相关）的基因YSL1的表达量明显增多。这表明LAJK和HAJS两种品系存在不同的Cd转运机制，从而造成品系间的Cd累积能力差异。

图3 两种品系的小白菜存在不同的镉胁迫应答机制

●基于多组学关联分析的植物抗逆调控机制研究方案
植物在逆境胁迫下的基因调控机制是非常复杂的生物学过程，利用单一组学技术通常不足以深入研究其机制。基因的转录调控、转录后调控、翻译调控等等在各个维度上可解释植物逆境胁迫的适应机制，这就需要以RNA-seq为核心的两组学甚至多组学关联分析。基迪奥将根据客户的材料特性、潜在的关键调控因子、关注的生物学问题、期望目标等，提供定制化多元化的多组学关联分析解决方案，助您逐步深入揭开逆境胁迫调控的分子机制。

案  例  解  读

案例一：干旱和盐胁迫抗性不同的水稻品系间的DNA甲基化调控差异^[4]
为了阐明水稻在非生物胁迫下的DNA甲基化调控机制，对三种品系（分别为抗盐、抗旱和胁迫敏感的品系）的水稻种子分别进行甲基化、转录组和小RNA检测。结果表明受甲基化调控的差异表达基因，显著与非生物逆境胁迫相关。同时也发现差异甲基化的转座子会对周边的蛋白编码基因的表达有所影响。另外，研究也揭示了小RNA潜在通过RdDM(RNA介导的DNA甲基化)对DNA甲基化有调控作用。这些结果从甲基化修饰、基因转录表达和小RNA调控三个层面，对水稻的非生物逆境胁迫机理进行了阐述。

图4  潜在与环境胁迫应答相关的基因的差异甲基化与差异表达水平。可以看出，这些基因的转录表达受到DNA甲基化调控。

图5 小RNA在编码基因区的分布与CHH的甲基化模式一致，表明小RNA影响基因组的从头甲基化。

案例二：白葡萄干旱胁迫适应机制研究^[5]
为揭示白葡萄在干旱胁迫下次生代谢物的调控机制、改善白葡萄种植地区由于干旱加剧导致的白葡萄酒品质影响，对开花后27,41,54,68,82,93天（DAA）的对照组葡萄和干旱组葡萄分别测定酚类、类胡萝卜素、生育酚和挥发性代谢物（VOC）；同时对41,68,93DAA的对照组和干旱组葡萄进行RNA-seq测序，将差异基因与差异代谢物联合分析。研究结果发现大部分酚类、胡萝卜素、生育酚物质在干旱组不同生长阶段中差异表达，12种挥发性物质的浓度在果实成熟的最后阶段（93DAA）升高，包括芳樟醇、橙花醇、alpha松油醇等单萜类物质（图6）。
对上述三种单萜物质和与其相关性最高的前100个基因构建代谢物-基因调控网络（图7A），发现调控网络中的大部分基因功能与萜类、脂类、激素代谢相关，也包括一些转运和信号通路基因。对调控网络中的这些基因进行启动子富集分析，发现很多上调基因的启动子区显著富集MYB和干旱应答转录因子结合位点（图7B），表明萜类代谢通路在响应干旱胁迫中起着直接的转录调控作用。

图6  干旱对葡萄不同发育阶段次生代谢物浓度的影响。A：酚类物质；B：胡萝卜素和生育酚；C：挥发性物质

图7 A：芳樟醇（1）、alpha松油醇（2）、橙花醇（3）的基因-代谢物调控网络。B：调控网络中基因的启动子顺式调控元件富集分析。粗体的顺式调控元件代表与干旱/ABA应答相关，下划线顺式调控元件代表MYB结合位点。

参考文献
[1] Takagi H, Tamiru M, Abe A, et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(5): 445-449.
[2] Lambel S, Lanini B, Vivoda E, et al. A major QTL associated with Fusarium oxysporum race 1 resistance identified in genetic populations derived from closely related watermelon lines using selective genotyping and genotyping-by-sequencing for SNP discovery[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2014, 127(10): 2105-2115.
[3]Zhou Q, Guo J J, He C T, et al. Comparative transcriptome analysis between low-and high-cadmium-accumulating genotypes of pakchoi (Brassica chin-ensis L.) in response to cadmium stress[J]. Environmental science & technology, 2016, 50(12): 6485-6494.
[4]Garg R, Chevala V V S N, Shankar R, et al. Divergent DNA methylation patterns associated with gene expression in rice cultivars with contrasting drought and salinity stress response[J]. Scientific reports, 2015, 5.
[5]Savoi S, Wong D C J, Arapitsas P, et al. Transcriptome and metabolite profiling reveals that prolonged drought modulates the phenylpropanoid and terpenoid pathway in white grapes (Vitis vinifera L.)[J]. BMC plant biology, 2016, 16(1): 1.

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