继去年8月在JNCI杂志发表关于circRNA翻译文章后，近日中山大学附属第一医院神经外科张弩副教授团队nature子刊又发表相关研究成果。

发表期刊：《Oncogene》
发表时间：2018
影响因子：7.519
合作单位：中山大学附属第一医院

研究背景
该研究通过circRNA测序和mRNA表达谱数据筛选了一组与神经胶质瘤显著相关的候选circRNA，并发现其中的circ-SHPRH能够编码17 kDa的SHPRH-146aa蛋白。进一步功能实验表明该蛋白能够抑制肿瘤的发展，该篇文章的发表是circRNA能够编码生物学功能蛋白的又一有力证据。

文章的亮点之一在于发现SHPRH-146aa蛋白由重叠密码子（起始和终止密码子共用一个碱基A，UGAUG）的ORF翻译而来，在真核生物中首次报道。

基迪奥参与并完成了circRNA的高通量测序和目标基因挖掘的工作，通过整合circRNA和mRNA两个RNA组学数据，缩小了筛选范围，大大地提高了目标基因的挖掘效率和准确率，为后续功能实验奠定了基础。

基迪奥具有丰富的多组学贯穿项目经验，已发表全转录组（ncRNA-mRNA，ceRNA），基因组重测序+转录组/代谢组，代谢组/蛋白组+转录组等多篇高分文章，提供丰富的多组学解决方案。

下面我们就重点了解下作者如何通过高通量和生信分析筛选目标circRNA？以及如何证明其翻译能力并进行后续研究？

研究思路

研究结果

1、circRNA-seq和特征分析
通过测序和生信分析总共鉴定到31,145个circRNA candidates，其中绝大多数是外显子型circRNA，还有部分circRNA由单一外显子形成，其它来源于内含子，基因间区和反义链（图1A）。不同染色体产生circRNA的数量也不同，本研究中1，2号染色体circRNA数量最多，Y染色体最少（图1B）。接着检索circBase数据库，可以注释6442种circRNA。

图1. circRNA类型和染色体分布

2、circRNA差异表达分析和目标分子筛选
通过组间差异表达分析，发现5498种显著差异（FDR ≤ 0.01，fold-change ≥ 2）的circRNA（2280个上调，3218个下调），对应的来源基因为3001个。接着，过滤掉低丰度的circRNA（RPM < 1），得到2709个circRNA，对应1688个来源基因。
由于作者反馈候选基因太多，无法筛选，于是基迪奥技术人员搜索NCBI芯片表达谱数据并下载分析胶质瘤和正常组织差异表达的mRNA，通过差异circRNA的来源基因和表达谱差异mRNA来协助筛选，缩小范围。最后发现了105个mRNA，注释circBase数据库后，得到41个差异circRNA，对应31个来源基因（图2）。

图2. 差异表达分析和多组学数据筛选

最后，作者根据来源基因的功能以及在胶质瘤中的低表达等特点，锁定目标circ-SHPRH。对其特征分析发现成熟的circ-SHPRH长度为440 nt，由其来源基因SHPRH的第26-29外显子反向拼接形成。Sanger测序证明circ-SHPRH的接口位置序列与circBase记录一致（图3）。

图3. 利用Divergent引物鉴定circRNA的接头位点

3、circ-SHPRH功能研究
设计环状表达载体和特异性的Junction探针（SH-circRNA），过表达及siRNA实验结合Northern杂交实验，在293T细胞中显著抑制和提高了circ-SHPRH表达。接着利用QPCR实验证明了circ-SHPRH在胶质瘤中显著低表达；FISH实验发现circ-SHPRH主要定位于细胞质中。

图4. circRNA功能实验

4、circ-SHPRH翻译元件分析
circ-SHPRH能够注释到circRNADb，含有ORF和IRES元件的特征，预测ORF编码一条146个氨基酸的多肽；此外，作者还发现该ORF起始和终止密码子共用一个碱基A，出现重叠密码子的现象。

图5. circ-SHPRH的翻译元件和编码蛋白预测

为了研究翻译元件的功能，作者首先通过比对分析发现circ-SHPRH的ORF在多个物种中高度保守。

图6. circ-SHPRH的ORF保守性分析

其次，作者通过报告基因实验，比较野生型IRES和突变IRES的活性，结果显示突变IRES的活性显著降低，说明野生型IRES具有较高的活性，可能引导翻译（图7）。

图7. circ-SHPRH的IRES活性检测

5、翻译蛋白的实验验证
作者构建circ-SHPRH过表达载体，通过特异性引物检测到在细胞中显著上调circ-SHPRH的表达；此外，设计特异性抗体Anti-SHPRH-146aa，Westernblot检测到体外细胞蛋白的过表达。

图8. circ-SHPRH过表达载体和体外蛋白表达

为了进一步证明SHPRH-146aa由circ-SHPRH翻译，作者利用LC-MS/MS质谱技术检测到内源性目的蛋白，质谱结果显示17KD的肽段覆盖了58%的SHPRH-146aa，并且包含一个环状RNA特异性junction肽段“AAILQKWK”。

图9. 质谱检测内源性目的蛋白

因此，通过上述体外和体内实验有力地证明了circ-SHPRH翻译了环状RNA特有的蛋白SHPRH-146aa。

6、SHPRH-146aa的生物学机制研究
根据前人报道，全长SHPRH蛋白能够能特异性介导PCNA的泛素化降解，而DTL会竞争性结合全长SHPRH促使其降解，从而引发癌症。

作者通过一系列过表达，敲低实验，显示SHPRH-146aa与PCNA蛋白也存在一定关系，因此推测SHPRH-146aa与全长SHPRH类似，也对蛋白泛素化作用通路有影响。

同时发现敲低circRNA后只对PCNA和全长SHPRH蛋白有影响，而mRNA水平没有明显变化，暗示生物学机制发生在蛋白层面，而非RNA层面。

接着进行放线菌酮（CHX）半衰期和CoIP等实验，发现SHPRH-146aa能够结合DTL，并稳定全长SHPRH蛋白，从而实现对PCNA蛋白的降解，降低肿瘤的发生。

图10. SHPRH-146aa的生物学机制

7、SHPRH-146aa预后分析，细胞学和动物模型分析
为了进一步探讨SHPRH-146aa蛋白的临床应用，作者利用 western blot研究了60例胶质瘤和相邻正常组织中SHPRH-146aa的表达水平，结果显示胶质瘤中表达显著低于正常组织。细胞增值和小鼠成瘤实验也证明SHPRH-146aa对肿瘤细胞有明显的抑制作用（图11C, D）。

生存分析表明高表达SHPRH-146aa或者全长SHPRH蛋白的病人预后生成率更高（图11A），说明SHPRH-146aa能够作为预后标记物。

图11. 预后分析和动物模型实验

小    结
1. 本文首次发现真核生物circRNA拥有重叠密码子（起始和终止密码子共用一个碱基A，UGAUG）的ORF，在生物体内翻译出功能性蛋白SHPRH-146aa。该现象此前只在病毒circRNA中被报道过，这种特殊的ORF序列形式也更加丰富了circRNA的研究内容；

2. circRNA测序得到的差异基因往往较多，本文巧妙利用来源基因与表达谱数据进行整合分析，从而大大缩小了目标circRNA的筛选范围；

3. 通过circ-SHPRH的来源基因和全长SHPRH蛋白来推测circRNA和其蛋白的功能已经在多个文章中得到验证，这也说明了来源基因对circRNA的重大影响，因此可以作为筛选目标circRNA的指标之一。

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