PNAS:多组学阐释虾青素合成机制 返回

随着三代测序技术的兴起,越来越多的基因组研究文章发表出来。藻类作为一种重要的能源生物,其基因组的发表尤为重要,近期一篇利用三代和二代测序技术分析微藻的文章,重新对微藻基因组进行组装和注释,为藻类的组学研究奠定基础。

虾青素在抗氧化性、抗肿瘤、预防癌症、增强免疫力、改善视力等方面都有一定的效果,因此是极具前景的保健品成分。在自然界中虾青素主要由藻类、细菌和浮游植物产生。

微藻是一类在陆地、海洋分布广泛,营养丰富、光合利用度高的自养植物,细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等,使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。C. zofingiensis(Chromochloris zofingiensis,佐夫色绿藻),绿藻属,属于微藻中的一种,因其含有高量的虾青素而具有重要的开发价值。

而绿藻基因组的系统研究和BKT1基因的发现将对利用生物工程手段对绿藻进行商业化开发以及相关生物能源和虾青素合成等领域产生重要的意义。


测序策略

基因组:三代Pacbio +二代基因组测序;

转录组:有参转录组测序。


研究思路

研究结果
1、低温软X射线下的C. zofingiensis 细胞形态
首先,从细胞形态角度出发进行观察分析,发现C. zofingiensis是一个4μm大小的单细胞,呈球形状的单倍体绿藻,其包含多个呈管状网络的线粒体、淀粉粒和叶绿体,无鞭毛结构(图1)。


图1 C. zofingiensis 细胞形态
A:重建细胞中有代表性的正片。B:三维分割图在两个正交orthosis。C:分段叶绿体;D:完整的分割细胞。其中有分段细胞核(紫色),叶绿体(绿色),线粒体(红色)、脂质(黄色)和叶绿体中的淀粉颗粒(蓝色)。

2、染色体水平基因组组装结果
C. zofingiensis中富含大量的虾青素,具有很高的研究价值,然而C. zofingiensis缺少一个完整的参考基因组,这样难以对虾青素的合成机制进行研究,为了深入研究C. zofingiensis中虾青素合成机制和生理活动,对C. zofingiensis进行染色体水平的基因组组装。

利用三代+二代基因组测序和作图技术,获得绿藻全基因组大小为58Mbp,组装出19条染色体,共编码基因1.5万多个。其中基因组上重复序列(<6%)和内含子都较少,大部分基因(>73%)具有直系同源的功能域(图2)。


图2 C.zofingiensis核基因组

图中显示19条染色体的分布情况,其中垂直的黑线表示BamHI酶切位点,在染色体边缘的黑色方块表示序列装配已经到达与端粒相关的重复序列水平;橙色线条表示组装出的间隙(gap);黄色线条表示额外的已知组装事件;蓝色底纹表示这部分序列并不是一一对应的,淡绿色底纹表示序列一一对应;红色点为中心粒位置。

3、组装结果分析
为了验证基因组组装的可靠性,利用BUSCO软件评估组装结果,发现C.zofingiensis与其他藻类相比,在基因组水平上组装完整性最佳,片段化和丢失的基因最少。进化树分析证明C. zofingiensis属于绿藻属。

通过分析C. zofingiensis与近缘种C. reinhardtii的同源共线性,发现随着时间的推移,两种藻类中存在一定程度上随机染色体重组并最终在重组形成后逐渐产生分离(图3 )。


图3 基因组分析

A:BUSCO评估组装效果, 4种藻类和拟南芥与C. zofingiensis同时进行评估,其中浅蓝色表示单拷贝完整匹配基因,深蓝色表示多拷贝完整匹配基因,黄色表示片段化匹配基因,红色表示未匹配基因。B:进化树结果。C: C. zofingiensis与C. reinhardtii的同源共线性分析。散点表示绿藻中保守基因的杂乱的共线性分块。

4、藻类虾青素表型和含量统计
组学上的研究往往需要与表型相结合,才能深入阐述感兴趣的生物学问题。首先利用UV射线随机突变C. zofingiensis,构建虾青素缺失突变体,对野生型和突变体进行高光强和中光强处理,发现在高光下野生型绿藻会合成虾青素变橙色,而在中等光强下WT与突变体一样均不合成虾青素(图4A-右上图)。进一步通过HPLC对高光强处理下WT和突变体中类胡萝卜素合成相关代谢物的含量进行测定,发现突变体中无虾青素合成(图4)。

前期研究发现藻类中胡萝卜素生物合成途径可以合成虾青素且BKT基因调控虾青素合成,对突变体中的BKT1和BKT2进行测序,发现在BKT1基因中存在突变位点,说明在C. zofingiensis中BKT1参与调控虾青素合成。


图4 突变体和野生型HPLC分析

A:突变体和野生型高光强下HPLC分析。其中高光强 (HL, 400–450 μmol光子·m−2·s−1),中光强(ML,100 μmol 光子·m−2·s−1);图中字母的含义为AST是虾青素A(antheraxanthin,环氧玉米黄质), α (α-carotene,α-胡萝卜素), Ast (astaxanthin,虾青素), β (β-carotene,β-胡萝卜素), Chl a(chlorophyll a,叶绿素a), Chl b (chlorophyll b,叶绿素b), L (lutein,叶黄素), N (neoxanthin,新叶黄素), V (violaxanthin,黄质),Z (zeaxanthin,玉米黄素)。黑色表示野生型,蓝色突变体。 B:统计细胞中除虾青素之外,其它代谢物质在野生型和突变体中的含量。颜色含义与A中一一对应。

5、转录组分析C. zofingiensis在不同光强下的表达差异
进一步研究光强对C. zofingiensis虾青素合成机制的影响,分别将C. zofingiensis在中光强和高光强下培养,对两种培养处理的不同时间点下取样进行RNA-SEQ分析。

首先,将之前的基因组的组装结果作为参考基因组进行表达量计算,利用PCA和热图聚类表达模式分析,发现样品间在早期0.5-1h时,光强比时间更影响样品聚类,而随着时间变长,样品按照时间聚类(图5A)。其中早期的0.5h和1h下基因表达模式几乎相同(图5B)。


图5 高光强和中光强下基因表达模式

A:PCA分析结果。不同颜色对应不同时间点; B:表达模式聚类分析。统计高光强下表达量与中光强比较后差异倍数为±2范围内的所有基因(P < 0.01)。上调为黄色,下调为蓝色,黑色无差异。图中方框圈出来的是一种类似比例尺,总体描述在不同时间点的log2FC的基因上下调比例,因为时间点不同,所以位置不同。

6、高光强与中光强对C. zofingiensis基因表达的影响
为了筛选出与虾青素合成途径相关的基因,对 C.zofingiensis在高光强和中光强下虾青素合成相关途径中基因表达模式进一步分析,发现在类胡萝卜素途径中BKT1 和BKT2在0.5-1h期间基因表达量随着光强升高,表达量显著升高,说明这两个基因在早期受光强介导调控参与虾青素生物合成途径。同时找到一系列参与虾青素生物合成的候选基因,包括ABC转运蛋白、细胞色素P450酶,和酰基转移酶等。


图6 高光强与中光强下基因表达模式

左图为整体光强之间的差异基因比较分析,统计HL vs ML下差异基因表达量为log2FC为±2范围内的基因。黄色表示基因表达量上调,蓝色表示基因表达量下调。右图为不同时间点与T=0对照相比,两种光照下整体的基因表达量聚类分析。图中聚类通路为类胡萝卜素合成途径,NPQ(非光学淬灭),叶绿素II合成和降解途径,这些通路均与虾青素合成相关。右侧为基因名,带*表示差异显著(P<0.01)。

总     结
1.  利用染色体组装、基因组测序和作图技术,发现绿藻全基因组大小为58Mbp,分布在19条染色体上,共编码基因1.5万多个。基因组上重复序列(<6%)和内含子都较少,大部分基因(>73%)具有直系同源的功能域。

2.  研究人员在绿藻基因组上发现了两个编码虾青素合成途径关键酶——β-酮醇酶的基因,功能鉴定表明基因BKT1参与调控虾青素的合成。

3.  利用转录组分析,发现一系列ABC转运蛋白、细胞色素P450酶,和酰基转移酶等基因参与虾青素生物合成。


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