第三代测序技术Pacbio利用单分子实时测序(SMRT)技术，基本原理是利用荧光标记的脱氧核苷酸，实时记录荧光的强度变化。无需组装即可直接获取5'端到3'端完整的全长转录本，具有超长的读长（平均15kb）。
因此可得到更高质量的转录本，有利于mRNA结构的研究，如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。全长转录本的研究越来越热门，发表的文章影响因子也比简单用二代测序RNA-seq要高。

 
图1SMRT测序原理图

推荐---最新升级的Sequel：测序通量更高、单Gb测序成本更低、项目周期更短！

产品特点
1超长读长
平均读长8~15kb，最长可达到约80kb，轻松解决二代测序所不能解决的重复序列问题；
2通量高
一个SMRT cell含有100万个ZMW，可产生5~10Gb数据；
3无GC偏好性
在高GC含量区可以完全跨过；
无PCR扩增偏向性不像二代测序通过大规模PCR扩增形成簇，三代测序在测序过程中无需大规模PCR扩增；
4直接检测碱基修饰DNA链合成过程中，形成的每两个相邻的脉冲峰之间有一定的距离，如果有碱基修饰，两个相邻峰之间距离加大，根据距离变化可以判断模板相应位点是否出现碱基修饰。

 
图2实验建库流程示意图

样本要求

样品浓度：总RNA浓度≥300ng/ul；
样品总量：总RNA量> 10 ug；
样品纯度：OD260/280：1.6~2.2；OD260/230：1.4~2.5；
胶图检测：条带清晰，无明显降解，无DNA污染；
2100检测：RIN值≥7.5，基线平整，200-1200bp 无峰带。 数据量：单个组织：至少8G；
混合样本：15G-20G。

分析方法

 
图3 分析方法

案例联合二代和三代测序揭示杨树转录组发育动态 发表期刊：Plant Biotechnology Journal（2018）影响因子：6.305 所有木本植物和一些非木本树木都经历了初级和次级生长，二次生长产生的生物量是生物燃料的来源。杨树（Populus）被用作研究二次生长的模型，了解杨树如何调节从初级生长到次生生长的转变可以帮助改善生物量生产。
联合二代和三代转录组测序，对南林895杨树（Populus Nanlin895）的枝端、1-3茎节和4-5茎节分别进行研究。

 
图4 三个样本isoforms分布维恩图（左）和样本isoforms鉴定饼图（右）

三代测序获得887,877 (55%)条全长序列，87,150条isoforms。枝端有22,146条组织特异isoforms，1-3茎节有17,017条，以及4-5茎节有18,464条（图4左）。将isoforms比对到杨树基因组(Pt_v3.0)，25,092条与基因组相同，59,977条为注释新isoforms，1575条可能为新基因（图4右）。接下来鉴定了1187个lncRNA和356个融合基因，均存在高度的组织特异性。

 
图5 顶芽与1-5茎节差异表达的转录本K-means聚类和富集分析

二代测序发现了来源于9,950个差异基因的15,838个差异转录本，K-means聚类将差异转录本分为9类。GO富集分析揭示细胞分裂和氧化还原在初级和次级生长期间都很重要，且不同发育阶段参与这些过程的基因不同（图5）。在杨树顶芽生长过程中，初生细胞壁和细胞伸长相关，次生细胞壁与水和物质运输有关；初生和次生细胞壁相关的转录本在茎中存在优势表达。

参考文献
Chao Q, Gao Z F, Zhang D, et al. The developmental dynamics ofthe Populus stem transcriptome[J]. Plant biotechnology journal, 2018