Stereo-Seq是一种空间转录组技术，该技术基于DNA纳米球(DNA Nano Ball,DNB)开发,是具有高通量、超高分辨率、大视场的原位全景式转录组技术，可以实现样本细胞级别的高分辨率空间转录组分析。Stereo-Seq通过空间芯片捕获组织中的mRNA，并通过时空条形码(CoordinateID，CID)还原回空间位置,实现组织原位测序，为深入地了解细胞的基因表达及形态与局部环境之间的关系建立强大的研究基础。
应用领域
1.空间细胞图谱；
2.空间组织结构；
3.复杂疾病机制；
4.疾病药物治疗；
5.肿瘤发生和发展；
6.组织病理学微区域；
7.生长分化发育；
8.植物逆境胁迫；
9.微生物与植物互作；
10.动植物遗传育种。
技术路线
分析内容
| 标准信息分析 | 高级信息分析 |
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1. 测序数据统计与评估：各个样本测序数据基本质控（总read数、测序饱和度等）、各个样本数据比对（组织覆盖区域检测、reads比对基因组比对率、reads比对基因组区域统计等）、基因表达定量； 2. 两种分割bin的数据质量统计：Square bin统计（不同bin值大小捕获到的read统计、基因检测数量、基因表达量统计）、cellbin统计（捕获细胞数量、细胞面积统计、细胞DNB数统计、细胞的基因检测数量、细胞的基因表达量统计） 3. bin聚类分群及数据可视化：bin聚类分群、bin亚群分类统计、bin亚群基因表达量统计、分群结果可视化（组织映射图、UMAP映射图）； 4. 亚群特征基因分析：亚群上调差异基因分析、亚群上调基因筛选和统计、亚群上调基因功能富集分析、亚群特征基因筛选、亚群特征基因分布可视化、蛋白质互作网络。 |
空间拟时空分析、空间通讯分析、 空间共表达模块分析、与单细胞转录组关联分析 |
样品要求/项目周期
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Q1：stereo-seq空间转录组的样本保存建议？
A：（1）速冻后的样本放在异戊烷中，冻在-80℃；（2）包埋后未切片的样本放在-80℃。包埋样本保存时注意密封，防止长期保存造成脱水。
Q2：包埋过程应注意什么？
A：包埋过程中需注意取材尺寸 ( 目前要求组织块尺寸不得大于0.9 cm x 0.9 cm x 2 cm)，选择合适尺寸的包埋盒。新鲜组织离体后需在30 min内完成包埋，操作时应在低温环境下快速进行，避免RNA降解。包埋前应吸干组织表面水分，避免产生冰晶，同时也要避免OCT中气泡的产生影响后续切片。
Q3：组织包埋时，OCT的量是否会对组织造成影响？
A：组织太小OCT太多的话，可能会对组织产生挤压。建议尽量选择跟组织大小适配的包埋盒。
Q4：stereo-seq空间转录组切片制备后，染色方法支持哪些？
A：H&E染色、ssDNA核染色、DAPI多色免疫荧光染色。
Q5：一个细胞的大小和Square bin size的关系是怎样的？
A：以一个细胞的直径为10 μm左右计算时，一个细胞相当于bin20（10 μm × 10 μm）或bin14（取diagonal = 10 μm）。
Q6：cellbin分割受到什么影响比较大，如何获得最佳分割效果？
A：cellbin分割受到算法限制，边界定义的原则和影像学有很大关系（清晰程度），对于密集区域可以用stereopy人工预测手动圈图；算法可以多种算法可以尝试（设置扩点大小，无背景扩点等）。
Q7：stereo-seq芯片有哪些规格的？
A：常见的大小为0.5 cm × 0.5 cm、1 cm ×1 cm这两种大小，也可以定制2 cm × 3 cm、3 cm × 5 cm、6 cm × 6 cm的芯片规格。
Q8：stereo-seq芯片的分辨率是多少？
A：由于每个DNB的直径为220 nm，则两个DNB间的距离为500 nm，所以常见的分辨率为500 nm。另外也可以根据项目需求定制分辨率为715 nm的芯片。
Q9：stereo-seq空间转录组的样本最少要求几个起测？
A：最少1个样本即可，也不用担心凑样的问题。
Q10：stereo-seq空间转录组技术适用于哪些物种？
A：目前已经发表的文章中包含的物种有人、小鼠、食蟹猴、鸡、果蝇、斑马鱼、蝾螈、拟南芥、洋葱、番茄、大豆、花生等，所以该技术适应于医学和农学的大部分物种。
案例一 Stereo-seq研究小鼠胚胎时空发育图谱
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1、结合DNA纳米球（DNB）模式阵列和原位RNA捕获技术，建立Stereo-seq（SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing）技术，相较于其他空间转录组技术，该技术拥有最大的捕获面积（174.24cm2）、最灵敏的基因捕获（1450个UMI/100μm2）和单细胞分辨率； 2、应用Stereo-seq生成C57BL/6小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5）至16.5天（E16.5）共53张矢状切面的空间细胞图谱，其中包括来自同一个E16.5胚胎的13张连续切片，并进一步秒速小鼠胚胎发育中晚期的器官发育基因的空间表达模式以及器官发育的轨迹，构建了小鼠器官发生时空转录组数据库（MOSTA）； 3、利用Stereo-seq构建的小鼠中晚期的胚胎时空转录组图谱，描述人类发育缺陷相关的1959个基因在小鼠胚胎中表达模式，并在单细胞精度下研究由WNT5A基因图标导致的罗宾诺综合征在小鼠上颚和肢体中累积的细胞类型，证明应用MOSTA解析发育过程中疾病相关基因表达的时空窗口和潜在累积细胞和器官方面的潜力。 |
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案例一 Stereo-seq研究拟南芥叶片细胞空间结构
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1、基于Stereo-seq空间转录组技术，结合植物细胞具有细胞壁这一特性，首次在植物研究领域中应用并绘制了拟南芥叶片横切面的空间细胞转录组图谱； 2、将时空组学技术应用于拟南芥茎生叶横切面，成功将高度想死的细胞亚群进行有效区分和分子特征解析（如表皮细胞细分为上表皮细胞和下表皮细胞，叶肉细胞细分为栅栏细胞和海绵细胞）； 3、首次从单细胞水平揭示了光合作用相关基因（PQL1、LHCA6、PSB29、PPL2、FNR1）的表达水平在空间上承宪从主叶脉到叶边缘方向上的梯度变化趋势。 |
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参考文献：
[1] Chen A, Liao S, Cheng M, et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays[J]. Cell, 2022, 185(10): 1777-1792. e21
[2] Xia K, Sun H X, Li J, et al. The single-cell stereo-seq reveals region-specific cell subtypes and transcriptome profiling in Arabidopsis leaves[J]. Developmental cell, 2022, 57(10): 1299-1310. e4.
