BS测序-基迪奥生物

全基因组甲基化测序：DNA甲基化在真核生物中提供了一个关键的表观遗传调控机制，在疾病、胁迫、遗传等生物学问题的研究中具有重要意义。DNA甲基化检测首先要进行甲基转化，目前主流方法是酶转法，这是一种无需亚硫酸氢盐、破坏性更小、效率更高的单碱基分辨率DNA甲基化测序方法。根据TET酶的作用原理，先实验TET2通过级联反应将5mC和5hmC氧化成5caC，5hmC在糖基化的作用下转化成5ghmC，随后利用脱氨酶APOBEC将C转换成U，最后PCR扩增后进行甲基化位点鉴定。DNA甲基化图谱分析，尤其是在基因组中检测5mC和5hmC是至关重要的，甲基化修饰会影响基因的表达。

应用领域

测序可精确到单个碱基的甲基化，能得到全基因组的甲基化位点信息，可用于全基因组DNA甲基化图谱制作；疾病关联分析；基因调控分析；疾病的甲基化标志物等。

技术路线

分析内容

1. 标准信息分析

a) 对测序数据进行base calling、raw data 数据整理及数据质量评估；

b) 去接头污染，去低质量reads和产量情况统计

c) 酶转化处理效率检测

d) 测序序列与参考基因组序列的比对

e) 深度和覆盖度分析

f ) C 碱基的甲基化水平

g) 全基因组甲基化水平分布趋势

h) 基因组DNA甲基化图谱

i) 差异甲基化分析

2. 高级信息分析

根据具体研究进行的细节分析

样品要求

样品类型：DNA 样品；

样品需求量：总量≥5μg，浓度≥50ng/μL；

样品完整性：DNA 无明显降解，需提供凝胶电泳检测胶图。

样品要求/项目周期

请咨询当地销售或拨打电话：020-84889324（医学）、020-84889314（农学）了解详情。

参考文献

[1] Liu, Y., Siejka-Zielińska, P., Velikova, G. et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat Biotechnol 37, 424–429 (2019).

[2] Lister, Ryan, et al. "Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences." nature 462.7271 (2009): 315.

[3] Akalin, Altuna, et al. "methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles." Genome biology 13.10 (2012): R87.

[4] Wang, T., C.E. Loo and R.M. Kohli, Enzymatic approaches for profiling cytosine methylation and hydroxymethylation. Molecular Metabolism, 2022. 57: p. 101314.

[5] Hamaguchi, Y., et al., Identification of unique DNA methylation sites in Kabuki syndrome using whole genome bisulfite sequencing and targeted hybridization capture followed by enzymatic methylation sequencing. Journal of Human Genetics, 2022. 67(12): p. 711-720.

[6] Vaisvila, R., et al., Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome research, 2021. 31(7): p. 1280-1289.

[7] Feng, S., et al., Efficient and accurate determination of genome-wide DNA methylation patterns in Arabidopsis thaliana with enzymatic methyl sequencing. Epigenetics & Chromatin, 2020. 13(1): p. 42.

Q1：可以对无参考基因组的物种进行Bisulfite研究吗？

A：Bisulfite-Seq前提是只能适用于有参考基因组的物种，但是其强烈依赖于基因组的完整程度，基因组质量的好坏会直接影响其后续的分析结果，因此BS更适合有较完整基因组信息的物种。

Q2：BS测序有哪些优势?

A：BS测序采用Bisulfite（重亚硫酸盐）处理，将所有C碱基转化为U（即测序中的T），发生甲基化的碱基不发生改变。Bisulfite处理使得后续的测序分析能够在全基因组水平，单碱基精度检测出发生甲基化的位点，能够高精度挖掘CpG等常见类型甲基化区域，还能够以基因为单位分析基因的差异甲基化修饰，帮助我们更加全面地阐述生物学问题背后的发生、调控机制。

Q3：Bisulfite-Seq在项目开始之前需要考虑哪些因素？

A：1) 是否为低甲基化率的物种；

2) 该物种的基因组完成情况如何（影响 Bisulfite-Seq 的比对）；

3) 基因组是否存在复杂因素：GC 含量偏高、杂合度偏高、转座子、重复区域等

蓖麻种子特有DNA甲基化模式分析

合作老师：中国科学院昆明植物研究所

发表期刊：Plant physiology

影响因子IF：6.841

研究思路

研究结果

1、参与甲基化的基因鉴定及组织特异性表达分析

1. 通过生物信息学分析发现蓖麻的8个甲基化酶：RcMET1-1，RcMET1-2，RcCMT1，RcCMT2，RcDRM1，RcDRM2，RcDRM3，RcDnmt2，和3个去甲基化酶：RcDME，RcROS1和RcDML3。

2. qPT-PCR结果显示这些甲基化关联酶在胚和胚乳不同发育阶段的表达模式不一样，这预示着在种子的不同发育时期，胚和胚乳的甲基化水平有可能成动态变化。

组织特异表达甲基化基因

图1 各甲基化关联基因在蓖麻不同组织的表达情况

蓖麻种子CHH甲基化具有物种特异性

图2 各物种胚和胚乳的甲基化组成分布比较

2、BS测序鉴定蓖麻特有甲基化模式

1. 相比于其他植物高比例CG甲基化，蓖麻种子有较高比例的CHH甲基化状态（达到68%）。

2. 相比于胚，胚乳表现出低CG和CHG甲基化，而CHH的甲基化水平几乎不变。

3. 相比于胚，胚乳基因区的CG，CHG，CHH及TE区的CG，CHG都显示低甲基化，唯独TE区CHH显示高甲基化。

相对稳定的CHH甲基化

表中表示蓖麻种子胚和胚乳的CG,CHG,CHH三种甲基化水平比较，相比于胚，胚乳的CG及CHG明显处于较低甲基化水平，但CHH的却没有明显变化。

3、差异甲基化（DMRs）分析

实验结果：

1. 发现20464个CG和25940个CHG的DMRs，其中99.9%在胚乳中都属于低甲基化。同时发现2727个CHH的DMRs，其中只有55.9%在胚乳中表现出低甲基化。

2. 相比于胚，胚乳的甲基化率更低（99.9%CG和CHG的DMRs，及55.9%CHH的DMRs），这与甲基化酶CMT和MET在胚的激活相关。

胚乳表现出低甲基化

表中表示各类型DMRs在胚和胚乳中的比较情况。

基因表达水平与甲基化水平呈负相关

图B表示基因28629.m000565在胚乳及胚中的甲基化比较，

图C是基因在胚乳和胚的表达量比较

4、DNA甲基化负调控基因表达

1. 低表达基因的上下游及基因区域都有高甲基化的CHG和CHH,表示甲基化在一定程度上抑制胚的基因表达。

2. 相比于胚，胚乳中高表达的基因都表现出5’，基因区，3’的CG和CHG低甲基化。这同样证明DNA甲基化与基因表达的负相关关系。

3. 挑选28629.m000565和30093.m000370两个在胚乳高甲基化的基因进行qPCR，发现其表达水平与甲基化水平呈负相关。

5、siRNA表达与DNA甲基化相关

实验结果：

1. 被24-ntsiRNA覆盖的区域显示出高CHG和CHH甲基化，表示siRNA与DNA甲基化相关。

2. 与胚相比，5个胚乳中参与RdDM的基因的低表达，证明RdDM与DNA甲基化有关。

3. 胚乳中，基因区域以及TE区域的siRNA覆盖度都与CHH的甲基化水平呈正相关，表示胚乳中高丰度的CHH与siRNA介导的RdDM有关。

siRNA在TE区大量覆盖

siRNA分别在胚和胚乳中的基因区以及TE区的覆盖情况

siRNA介导RdDM调控CHH甲基化

图示siRNA覆盖度影响胚和胚乳的DNA甲基化水平

参考文献

[1]Xu Wei,Yang Tianquan,Dong Xue,Li De-Zhu,Liu Aizhong. Genomic DNA Methylation Analyses Reveal the Distinct Profiles in Castor Bean Seeds with Persistent Endosperms.[J]. Plant physiology,2016,171(2).