BS测序-基迪奥生物

全基因组甲基化测序：DNA甲基化在真核生物中提供了一个关键的表观遗传调控机制，在疾病、胁迫、遗传等生物学问题的研究中具有重要意义。DNA甲基化检测首先要进行甲基转化，目前主流方法是酶转法，这是一种无需亚硫酸氢盐、破坏性更小、效率更高的单碱基分辨率DNA甲基化测序方法。根据TET酶的作用原理，先实验TET2通过级联反应将5mC和5hmC氧化成5caC，5hmC在糖基化的作用下转化成5ghmC，随后利用脱氨酶APOBEC将C转换成U，最后PCR扩增后进行甲基化位点鉴定。DNA甲基化图谱分析，尤其是在基因组中检测5mC和5hmC是至关重要的，甲基化修饰会影响基因的表达。

应用领域

测序可精确到单个碱基的甲基化，能得到全基因组的甲基化位点信息，可用于全基因组DNA甲基化图谱制作；疾病关联分析；基因调控分析；疾病的甲基化标志物等。

技术路线

分析内容

1. 标准信息分析

a) 对测序数据进行base calling、raw data 数据整理及数据质量评估；

b) 去接头污染，去低质量reads和产量情况统计

c) 酶转化处理效率检测

d) 测序序列与参考基因组序列的比对

e) 深度和覆盖度分析

f ) C 碱基的甲基化水平

g) 全基因组甲基化水平分布趋势

h) 基因组DNA甲基化图谱

i) 差异甲基化分析

2. 高级信息分析

根据具体研究进行的细节分析

样品要求

样品类型：DNA 样品；

样品需求量：总量≥5μg，浓度≥50ng/μL；

样品完整性：DNA 无明显降解，需提供凝胶电泳检测胶图。

样品要求/项目周期

请咨询当地销售或拨打电话：020-84889324、020-84889314了解详情。

参考文献

[1] Liu, Y., Siejka-Zielińska, P., Velikova, G. et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat Biotechnol 37, 424–429 (2019).

[2] Lister, Ryan, et al. "Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences." nature 462.7271 (2009): 315.

[3] Akalin, Altuna, et al. "methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles." Genome biology 13.10 (2012): R87.

[4] Wang, T., C.E. Loo and R.M. Kohli, Enzymatic approaches for profiling cytosine methylation and hydroxymethylation. Molecular Metabolism, 2022. 57: p. 101314.

[5] Hamaguchi, Y., et al., Identification of unique DNA methylation sites in Kabuki syndrome using whole genome bisulfite sequencing and targeted hybridization capture followed by enzymatic methylation sequencing. Journal of Human Genetics, 2022. 67(12): p. 711-720.

[6] Vaisvila, R., et al., Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome research, 2021. 31(7): p. 1280-1289.

[7] Feng, S., et al., Efficient and accurate determination of genome-wide DNA methylation patterns in Arabidopsis thaliana with enzymatic methyl sequencing. Epigenetics & Chromatin, 2020. 13(1): p. 42.

Q1：可以对无参考基因组的物种进行Bisulfite研究吗？

A：Bisulfite-Seq前提是只能适用于有参考基因组的物种，但是其强烈依赖于基因组的完整程度，基因组质量的好坏会直接影响其后续的分析结果，因此BS更适合有较完整基因组信息的物种。

Q2：BS测序有哪些优势?

A：BS测序采用Bisulfite（重亚硫酸盐）处理，将所有C碱基转化为U（即测序中的T），发生甲基化的碱基不发生改变。Bisulfite处理使得后续的测序分析能够在全基因组水平，单碱基精度检测出发生甲基化的位点，能够高精度挖掘CpG等常见类型甲基化区域，还能够以基因为单位分析基因的差异甲基化修饰，帮助我们更加全面地阐述生物学问题背后的发生、调控机制。

Q3：Bisulfite-Seq在项目开始之前需要考虑哪些因素？

A：1) 是否为低甲基化率的物种；

2) 该物种的基因组完成情况如何（影响 Bisulfite-Seq 的比对）；

3) 基因组是否存在复杂因素：GC 含量偏高、杂合度偏高、转座子、重复区域等

WGBS及蛋白质组揭示i-CRISPR：一种通过减少癌症特异性突变的个性化癌症治疗策略

合作单位：中国人民解放军海军军医大学

发表期刊：Mol Cancer

研究背景：目前，癌症主要通过手术、化疗和放疗治疗，但仍有大部分患者不能完全治愈。大多数情况下，手术并不能清除所有的癌细胞，而其他策略，如放疗和化疗，在杀死癌细胞时，往往会对正常组织造成严重的不良影响。因此，开发一种专门杀死癌细胞而不诱导明显损害正常细胞的策略，可能对癌症治疗具有重要的临床意义。本研究中，作者开发了一种新的精确的个性化策略“i-CRISPR”，通过添加DNA损伤修复抑制剂和通过CRISPR诱导癌细胞特异性DNA双链断裂，来治疗癌症，为精确的癌症治疗提供一个新概念。

取材：1）定量磷酸化蛋白质组学：HepG2细胞分为三组：NC、C-Cut和C-Cut-2i，每组三个样本。NC（阴性对照）组仅用 Cas9 处理；C-Cut（CRISPR-Cut）组用T8组中的Cas9和8gRNA处理；C-Cut-2i（CRISPR-Cut&2i）组用T8组中的Cas9和8gRNA以及2种DNA损伤修复抑制剂（NU7441和KU55933）进行治疗。处理 72 小时后，收获细胞用于磷酸化蛋白质组分析。

2）HepG2细胞分为两组：NC和C-Cut-2i。NC（阴性对照）组仅用 Cas9 处理，而在 C-Cut-2i（CRISPR-Cut& 2i）组中，针对选定的 8 个 HepG2 突变位点和 2 个 DNA 损伤修复抑制剂的 Cas9-gRNA 腺病毒的混合物（NU7441 和 KU55933) 被添加到培养的 HepG2 细胞中。DU145 细胞也分为两组：NC 和 C-Cut-2i。NC（阴性对照）组只用Cas9处理，C-Cut-2i（CRISPR-Cut&2i）组用7种gRNA和2种DNA损伤修复抑制剂（NU7441和KU55933）的Cas9慢病毒和混合慢病毒处理，处理后三天，收获细胞提取基因组 DNA进行全基因组甲基化测序。

结果：1）磷酸化蛋白都主要定位于细胞核内，与NC组相比，C-Cut组中大多数改变蛋白的磷酸化水平增加，GO分析表明它们在染色质组织和DNA损伤相关通路中富集，特别是自噬，表明自噬的激活可能在C-CUT-2i组细胞死亡增加的分子机制中发挥了关键作用。

2）全基因组测序对人肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2的DNA序列进行了初步分析，鉴定出3,985,698个单核苷酸变异(SNV)和817,723个插入-缺失突变(indels)。

3）GO分析发现，甲基化区域（DMRs）定位的基因也在细胞死亡、程序化细胞死亡和染色体组织途径中富集。

4）全基因组甲基化测序结果表明，单细胞克隆在不断进化，产生新的突变，并表现出异质性，然而，在每个克隆的所有突变中，只有一小部分是各自克隆所特有的，并且大部分原始突变被保留。

图2 i-CRISPR"策略诱导细胞杀伤的分子机制

参考文献

Jiang, Junfeng, et al. "i-CRISPR: a personalized cancer therapy strategy through cutting cancer-specific mutations." Molecular Cancer 21.1 (2022): 164.