Ribo-seq（翻译组测序）-基迪奥生物

翻译组测序是指对与核糖体结合的正在翻译的RNA片段进行测序，来准确获取样本中所有可翻译分子（包括mRNA和其他潜在可翻译RNA分子如lncRNA, circRNA等）的信息与精确定量，是连接转录组与蛋白质组之间的桥梁。Ribo-seq (Ribosome profiling sequencing)是最常用的一种翻译组测序技术，该技术利用RNA酶消化细胞中的RNA，得到被核糖体保护的正在翻译的RNA片段（ribosome footprints, RFs），然后对这些RFs进行富集、测序与分析。翻译组测序可以研究细胞内基因翻译的水平、区域、速率等，结合转录组、小RNA测序、蛋白组等进行关联分析，可以更精确地研究转录后调控、翻译调控机制。

应用领域

1. 动植物逆境胁迫下的调控机制

2. 个体发育衰老的分子机制

3. 肿瘤发生发展机制

技术路线

分析内容

1. 标准信息分析

a) 原始数据过滤与测序质量评估

b) 比对去除核糖体RNA、tRNA、sRNA等

c) Reads长度分布统计与长度过滤

d) 比对参考基因组

e) 测序饱和度分析

f) RF在基因组上的分布统计与分类

g) 三碱基节律分析

h) 各长度RFs比对密码子分布

i) 翻译暂停分析

j) 翻译基因统计与表达量分析

k) 样本关系分析

l) 组间差异翻译基因分析

m) 差异翻译基因的GO/KEGG功能富集分析

n) GSEA

o) sORF鉴定、定量、注释

2. 高级信息分析（与转录组关联分析）

a) 基因翻译水平与转录水平比较

b) 翻译效率计算

c) 翻译效率与转录水平的关系分析

d) 差异翻译效率分析

e) 基因翻译效率差异与转录差异比较

f) uORF对翻译效率影响分析

3. 个性化定制分析

a) circRNA翻译分析

b) Small ORF（uORF/dORF, lncRNA等）翻译分析

c) 与蛋白质组的关联分析（需有蛋白质组数据）

d) 与m6A的关联分析

样品要求/项目周期

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参考文献

[1] Ingolia N T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(3): 205-213.

[2] Brar G A, Weissman J S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2015, 16(11): 651-664.

[3] Sendoel A , Dunn J G , Rodriguez E H , et al. Translation from unconventional 5′ start sites drives tumour initiation[J]. Nature, 2017, 541(7638):494-499.

Q1：翻译组需要做生物学重复吗?

A：建议做生物学重复。因为翻译组需要做定量分析，而涉及到定量分析的组学，需要进行组间的差异分析, 生物学重复不仅可以提供差异分析的检验基础, 而且可以证明结论具有普适性。

Q2：翻译组中如何对ORF进行编码能力预测？

A：首先如果一个sORF内有越高的RFs信号，则代表在这个区域有越多核糖体复合物停留，则其可以翻译蛋白的可能性越大。因此首先用唯一比对的reads进行FPKM计算，至少在一组样本中平均FPKM大于1的ORF才会进行编码能力的预测。

Q3：翻译效率（TE）怎么理解?

A：翻译效率代表样本中某个基因的总RNA分子与核糖体结合并进行翻译的比例。利用Ribo-seq和RNA-seq的数据，可以直接计算这个数值，TE的计算公式为：TE ＝ (FPKM in Ribo-seq / (FPKM in RNA-seq)，可以用来衡量单位转录本上结合的核糖体数目，也就是翻译量的多少。

翻译组测序揭示经典lncRNA形成环状RNA后可翻译功能多肽

合作单位：中山大学附属第一医院

发表期刊：nature communications

影响因子：12.353

研究背景

随着2017年的第一篇报道环状RNA被发现可翻译, 环状RNA翻译为环状RNA的功能研究提供了新的方向。从逻辑上说，多肽属于微量就可以起到巨大效应的分子，所以对于较低丰度的环状RNA更有可能通过翻译多肽来起到生物学作用。中山大学附属第一医院的张弩教授在之前的研究中，分别报道了蛋白编码基因（FBXW7和SHPRH）在形成环状RNA后形成新的功能多肽，且具有肿瘤抑制功能。

文章概要

研究者通过翻译组测序与转录组测序以及生物信息学分析，锁定了并发现了长非编码RNA LINC-PINT的第2外显子通过单独自身环化形成了环状的RNA分子Circ-PINT。后续的功能与机制研究进一步发现：

（1）线性RNA环化后，可以改变亚细胞定位方式。环化后的RNA分子定位于细胞质，而全长LINC-PINT母基因定位在细胞核；

（2）证实Circ-PINT可翻译多肽。通过制备特异性抗体和CRISPR/cas9基因敲除细胞株，证实环状RNA circ-PINT通过内部核糖体插入位点序列IRES驱动翻译一个由87个氨基酸组成的全新多肽。

（3）医学功能分子研究三部曲：分子功能、分子机制、临床相关性研究，都证明了circPINT可以翻译多肽，这个多肽有抑制肿瘤细胞的作用。

研究思路

研究结果

1. 翻译组联合转录组测序技术，发现非编码来源的环状RNA潜在可以翻译多肽。

1）通过对正常脑细胞和脑胶质瘤细胞进行RNA-seq测序和RNC-seq测序，两个组学的差异环状RNA交集共涉及320种环状RNA。这意味着这320个环状RNA潜在是可以翻译的功能环状RNA。

2）在这320个环状RNA中，有10个环状RNA来源的母基因是已报道的非编码基因。这10个环状RNA中，有5个环状RNA上可以找到完整的ORF。

3）研究最终锁定了LINC-PINT：因为这个基因之前已经被报道过作为非编码RNA有抑癌作用，主要参与细胞内的染色体组蛋白表观修饰。

2.1circPINT分子定性、定量与亚细胞定位

通过PCR、sanger测序、Northern blot、FISH等实验验证circ-PINT在细胞中的表达情况及大小和亚细胞定位。

图1 环状RNA circ-PINT的定性定量验证

图2 利用表达载体和抗体等证明circPINT可以翻译多肽

2.2验证circ-PINT编码多肽

研究发现在circ-PINT中存在内部核糖体插入位点序列（IRES），并用双荧光素酶系统证明了其活性。通过构建环状RNA表达质粒以及制备特异性抗体结合蛋白质谱证实环状RNA circ-PINT通过内部核糖体插入位点序列IRES驱动翻译一个由87个氨基酸组成的全新多肽。

3. 医学功能分子研究三部曲

3.1分子功能研究

通过构建融合红色荧光蛋白发现环状circ-PINT翻译的多肽主要定位在细胞核内。通过细胞周期、细胞增殖平板克隆等实验，发现87aa多肽可以导致细胞周期G1期阻滞，从而抑制肿瘤的增值。在两株低恶性的细胞中（HS683和SW1783），用CRISPR/cas9做基因敲除突变后，发现细胞的恶性程度增加，再次验证了circ-PINT翻译的87aa扮演一个抑癌基因的功能。

3.2分子机制研究

构建flag标签融合蛋白，然后做IP后蛋白质谱鉴定到和87aa可能发生结合的蛋白；发现PAF1蛋白可能和其结合，通过分子模拟及coIP实验验证，发现了87aa可以和PAF1结合。而PAF1复合物可以与RNA聚合酶II结合，在转录延伸中起着重要作用。后续还通过了chip等实验验证了87aa和PAF1结合后调控的一些癌基因的转录，PINT87aa的存在可以抑制这些癌基因的转录作用。

图3 IP实验加蛋白质谱寻找与PINT87aa互作的蛋白

图4 通过临床样本和动物实验再次证明PINT87aa的功能是实锤

3.3临床相关指标的验证

通过检测临床脑胶质瘤以及其它肿瘤（乳腺癌、肝癌、胃癌）组织标本，发现环状RNA circ-PINT以及翻译的 87aa蛋白是在肿瘤里面低表达；小鼠脑部原位以及皮下成瘤实验显示了过表达87aa蛋白的肿瘤细胞，成瘤能力大大减弱，动物生存期延长，而基因敲除低成瘤细胞中circ-PINT的编码区的部分序列后，动物的成瘤能力得到增强，证实环状RNA circ-PINT翻译的多肽具有抑制肿瘤的作用。

参考文献：

Zhang, Maolei, et al. "A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma." Nature communications 9.1 (2018): 1-17.