10x Genomics单细胞免疫组库测序又称10x单细胞V(D)J测序,指通过特异性提取富集T/B细胞TCR/BCR区域RNA,通过比对、拼接、筛选、注释等构建免疫组库,分析得到TCR/BCR多样性序列,从而获得机体的免疫特征。
 
利用微流控芯片制备单细胞体系;选择5'端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行V(D)J富集;实现成对的重链和轻链(B 细胞)或 α 和 β 链(T 细胞)的V(D)J测序。
 
 
 
 
应用领域
 
  1. 免疫生物学;
  2. 肿瘤免疫治疗;
  3. 辅助抗体/疫苗研究;
  4. 免疫系统疾病研究;
  5. 移植和免疫重建。
 
 
 
技术路线

 

 

 

分析内容

标准信息分析 (需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果)
定制化信息分析
1. 测序数据统计与评估;
2. 比对与注释:样本基本信息结果统计、样本contig注释信息结果统计、样本consensus注释信息结果统计;
3. Clonotype分型;
4. 特征分析、CDR3特征分析、V/J基因特征分析、V-J paired特征分析;
5. 多样本分析:样本间Clonotypes比较、Overlapping Clonotype聚类分析、Overlapping Clonotype差异分析。
和10x Genomics 5’转录组关联分析。
 

 

 
 
样品要求/项目周期

 

 

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参考文献

 

[1]Azizi E, Carr A J, Plitas G, et al. Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment[J]. Cell, 2018, 174(5): 1293-1308. e36.
[2]Guo X, Zhang Y, Zheng L, et al. Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing[J]. Nature Medicine, 2018, 24(7): 978.
[3]Zemmour D, Zilionis R, Kiner E, et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR[J]. Nature immunology, 2018, 19(3): 291.
[4]Paulson K G, Voillet V, McAfee M S, et al. Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 3868.

 

 

 

 

 

 

Q:单细胞转录组、空间转录组和 bulk 转录组区别?

A:三者都属于检测 mRNA 表达水平的转录组技术。区别主要在于分辨率和分析维度的不同。

普通转录组获得的是混合细胞的基因平均表达水平;单细胞转录组通过对单个细胞人为标记,获得群体内单个细胞的基因表达谱,有助于发现新细胞、挖掘细胞的异质性;而空间转录组则是直接在组织原位上进行 mRNA 捕获,同时获取细胞的空间位置信息和基因表达数据,从而进一步推动对组织原位细胞真实基因表达的研究

 

Q:10X单细胞标记的细胞数目范围一般是多少?细胞标记上的数目是越多越好吗?还有捕获率偏低是什么原因?

A:标记效率官方是 65%,如果悬液质量比较好,活性高,杂质少,基本都可以达到这个效率,甚至比这个效率还高。

但实际上除了跟效率有关,还跟细胞数目计数准确性有关,因为细胞计数的时候,我们数的视野是很有限的,所以,细胞计数准确性不一定都能保证,所以也会造成标记效率的波动。标记上的细胞多,那么拿到的细胞肯定也多,但是也会有另一种问题,就是单个细胞的数据量少了,所以这里要做一定平衡。捕获率低跟悬液质量关系比较大,杂质,碎片这些往往捕获率低。

 

Q:单细胞测序需要做重复吗?如果做重复的话,是几个重复?

A:重复这问题可以参考普通转录组的演化历史。

首先一个基本逻辑,任何生物学实验都需要做重复的,这是第一点逻辑;第二审稿人也会考虑可执行性。以普通转录组为例,在 2010 年时,普通转录组非常昂贵,一个转录组好几万。那么审稿人也非常理解这一点,所以如果你不做重复的话,通常审稿人也不会太多质疑这一点;随着价格下降以后,审稿人默认大家能够承担这个实验成本了,一般就会要求做重复, 这是普通转录组的演化。即随着成本的不断下降,做重复慢慢的会作为要求多起来。

再说回单细胞,目前单细胞转录组发文章,一般不要求做重复,主要原因还是太贵。但从未来来说,可能随着价格下降,慢慢审稿人可能会要求做重复。

从单细胞测序做重复的必要性来说 ,还需要具体问题具体分析。如果只是关注基因表达, 做细胞的鉴定,然后挖掘一些目标 marker,然后做下游的验证。因为这个研究下的文章重点,其实还是需要有下游验证的。这种情况下不做重复,也没问题。

但如果文章很多结论都来自单细胞测序,那做重复会更可靠。比如关注的是细胞频率,即细胞的比例的变化。因为本身单细胞悬液制备过程中前处理、消化、制悬液以及细胞核的提取这中间其实是有误差的。如果不做重复,然后文章结论又说处理组相比对照组某个细胞比例下降了。其实这结论可能是成疑问了。当然如果单细胞测序没做重复,但后面用流式的方法,做细胞比例验证,那也可以的。

总结来说,做不做重复,还是要考虑成本以及文章的主要结论。推荐最好做 3 个。但考虑性价比的话,两个重复是性价比较高的策略。用最小的成本解决重复的问题。

 

Q:单细胞核测序优势

A:和单细胞测序相比,单细胞核测序的优势在于:

1)细胞核的大小远远小于原生质体细胞,这就避免因为原生质体悬液中有较大的细胞而放弃上机标记。

2)同时,细胞核提取的偏好性小于原生质体制备,能更好地代表整个组织中,真实的细胞类型组成。

3)而且单核提取过程避免了长时间对组织进行酶解消化,进而避免了对基因表达产生影响,可以获得更真实的基因表达情况。

4)有些研究可能需要跨越一个部位的不同生长发育时期,或者实验处理后不同时间点取样,整个周期可能较长,同一批次进行原生质体制备难度比较大,而细胞核制备的话,则可以把不同时期的样本,分别收集进行液氮速冻保存起来,之后同一批次进行单细胞核的制备和标记测序。

5)另外,如果使用细胞核进行单细胞测序研究,则可以应用转录组测序+ATAC 测序多组学联合标记,对每个核同时进行转录本信息以及染色质开放性信息捕获。

6)提取的细胞核,可以使用流式细胞分选等手段,去除大部分碎片杂质和次生代谢产物,获得高纯度的细胞核。

同时也要注意,对细胞核进行测序,细胞质中转录本信息就丢失了,获得的是核内转录本信息,核内的 mRNA 主要是正在加工的新合成 mRNA,并且其含量是少于胞质 mRNA 的。不过众多文献报道核 mRNA 和细胞总 mRNA 的相关性是很高的,分群效果是一致的。

 

Q:marker 基因怎么获得?

A:1)cellmarker:http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/,包括人的 158 个组织 (亚组织)的 467

个细胞类型的 13,605 个 Marker 基因,和鼠的 81 个组织 (亚组织)的 389 个细胞类型的 9, 148 个 Marker 基因;

2)文献梳理;

3)亚群上调表达基因推测;

4)近缘物种的同源基因;

5)基迪奥公司积累数据库

 

 

   

 

 

 

 

 

 

胆管闭锁的致病机制和治疗方案

合作单位:广州市妇女儿童医疗中心

发表期刊:《cell》

影响因子:38.637

 

 

 

 

研究背景

 

胆管闭锁(biliary atresia, BA)是一种由肝外胆管阻塞介导的严重胆管病,在婴儿期可引起病理性黄疸和肝衰竭。因地域差异,发病率在1/5000-1/18000之间,不治疗会在一年出现肝衰竭。肝门吻合术是现在唯一的治疗手段,但术后依然有50%的患儿因为肝硬化而需要在两年内再次进行肝移植手术,且大多数伴有反复胆管炎、门静脉高压等并发症。

 

文章借助单细胞转录组和单细胞免疫组技术绘制了BA患儿的肝脏免疫细胞图谱,并从免疫的角度解释了BA的肝硬化和肝衰竭机制;在后续的一项探索性临床试验中,发现利妥昔单抗对BA患儿肝脏免疫环境恢复有积极作用。

 

 

 

研究思路

 

文章从6BA患儿、6例囊肿癌变患儿和4例无黄疸对照儿童的组织活检样本进行单细胞转录组和单细胞免疫组测序,获得159622个免疫细胞的转录组数据,并划分为42个细胞群体。

 

 

 

研究结果

 

 

CD4+ T细胞的克隆型分析

可以看到ex-cTh17cTh1的共享克隆型在BA患儿中明显升高,IFN-γ的表达量上升可能促进了Th17Th1的转化。这一转化过程增加了CD4+ T细胞的细胞毒性作用。

 

CD8+ T细胞的亚群细胞数量显示,在BA患儿中,CD8Trm细胞数量增多而CX3CR1+ CD8Teff细胞减少,共享克隆型分析显示CX3CR1+CD8Teff细胞具备向CD8Trm细胞转化的能力;而免疫细胞的CX3CR1向肝脏星状细胞CX3CL1的募集和粘附又可以抑制细胞纤维化。所以,细胞毒性作用的上升和CX3CR1免疫细胞的减少促进了肝脏纤维化。

 

1 T细胞图谱

A) T细胞分群tSNE图;B) 不同T细胞亚群在样本的细胞比例;C) 不同样本不同CD4+ T细胞亚群之间的共享克隆型比例;

D) 不同样本不同CD8+ T细胞亚群之间的共享克隆型比例

 

 

 

B细胞分析

 

1)婴儿在出生后,肝脏依然具备生成B细胞的能力,表现为造血干细胞、pre-pro-B细胞至记忆B细胞、浆细胞一系的细胞的存在;

2BA患儿肝脏的BCR具有自身免疫的特征,作者认为这是中枢耐受缺陷引起的,进而引起了肝脏损伤;

3BA患儿肝脏的B细胞发生CSRclass switch recombination)的频率显著下降,使得具有保护性质的IgM浓度降低,具有杀伤作用的IgG浓度升高,这进一步诱发了肝脏损伤。

 

2 B细胞图谱

A) T细胞分群tSNE图;B) 不同样本记忆B细胞的BCR类型频率统计图;

C) 不同IgM/IgG比例患者的无黄疸生存曲线

 

 

基于BA患儿的免疫细胞特征,作者认为B细胞修饰疗法可以缓解BA的肝损伤。在注射了利妥昔单抗(anti-CD20,清除成熟B细胞)后,患儿的肝脏免疫环境逐渐恢复为正常水平。

 

 

3 利妥昔单抗治疗前后免疫微环境模式图

 

 

小结

从文章的结果我们可以看到多组学联用的优势,免疫组提供的克隆扩增信息锁定了关键的免疫细胞亚型,转录组提供的表达量信息确定了关键的作用分子,这种关联加速了BA分子机制的研究。

 

文章还采用了拟时分析来构建T细胞亚型之间的转化关系,转录因子分析来寻找B细胞亚型分化命运相关的转录因子,为T细胞介导的纤维化和B细胞介导的细胞损伤机制提供了更全面的机制解析。

 

从这篇cell我们可以看到,多组学和个性分析已经是现在单细胞测序的重要内容,无论对于加速分子机制研究还是提高文章档次都有裨益。基迪奥的服务模式可以很好地解决单细胞测序伴随的个性分析需求。单细胞悬液实验优化、分析方法定制、分析参数优化、数据专业解析、潜在亮点建议、论文框架建议、关键图表绘制、审稿意见回复是基迪奥提供的交互式个性化服务,为个性化要求高的单细胞测序保驾护航。

 

 

 

参考文献:
Wang J, Xu Y, Chen Z & et al. Liver Immune Profiling Reveals Pathogenesis and Therapeutics for Biliary Atresia. Cell. 2020: S0092-8674(20)31455-0. Doi: 10.1016/j.cell.2020.10.048