点突变检测，属于个体重测序。但在实验设计策略上，属于case-control^[1] 比较 + BSA^[2]的结合策略。以上3方面内容要注意的问题，在重测序类的其他项目设计上依然可以借鉴。

（1）测序深度：建议不低于30X——个体重测序的维度

30X，这是个体重测序的金标准，即测序量是基因组大小的30倍。主要还是要保证对全基因组有良好的覆盖，并对突变有良好的检出率。有时，有老师会无奈地问我们，经费进展，能不能先测15X看看效果再说？作为工程师，我也只能无奈地摇摇头：“如果只测15X，会可能会丢失30%的信息，而这丢失的30%，还是随机的。我们肯定都不想看到这样的剧情——得到一堆数据，验证了半天，最后其实真正的答案在未知的30%里面。那不是白忙活了吗？对于科研，有时候50%的投入，可能却难以得到50%的效果。所以，你还是找我们公司销售员好好谈谈，哪怕给你最低的折扣。即使我们公司少挣一点，也不建议你在必要的数据量上省钱啊。”

虽然，2012年在Nature biotechnology 上发表的Mutmap文章^[2]说，只测10X也可成功。但我们还是呼吁不要完全相信文章，就如同我们从来不要太相信手机电池标称的续航时间一样（那都是理想条件下… … 你懂的）。

另外，还涉及到计算每一个位点的基因频率，当然也需要测序深度的保证。一个实际基因频率为50%的位点，如果测序深度只有4X，则期望值是2:2。但测序随机波动一下，就是可能变成1:3了，于是观测基因频率=75%, 走远了……但如果测到30X，则期望值是15:15，要随机波动到7:23，显然难度大很多。其实基因频率计算如同抛硬币，抛的次数越多（这里就是测序量越大），越接近真实频率。这也是为什么在肿瘤研究中，为了研究低频的突变，需要将测序深度提高到50X以上，主要为了提高低频突变检测的可靠性（包括减少测序错误的干扰）。、

（2）数据过滤——case-control的维度。

在此类研究中，我们一般需要使用野生型的样本【control】，来去除突变体【case】的背景变异，来找到真正的新突变。这里有个简单的原则：control应该尽量降低假阴性，即降低SNP过滤的阈值，最大限度地找到背景变异。case组应该尽量降低假阳性，即提高SNP过滤的阈值，保证新突变的检测尽可能真实。这些经验都是文献没有告诉我们的，我们是吐血分享啊。

（3）混合的样本数：建议不少于30个个体——BSA的维度。

类似的，还是涉及计算基因频率的问题。如果混合的样本过少，不良影响与测序深度不足类似，将导致随机误差对基因频率的影响非常巨大。例如只测混合了8个个体，无论是在DNA混合过程中的轻微误差，还是后续测序的随机波动，都会引入大量随机误差。30个，还是符合一个统计学上的大群体的概念，保证可靠性。当然，个体越多越好。另外，对于DNA提取，如果个体提取工作量太大，可以选择先混合组织再一起提取。

不过，有的老师会问：“如果我混样200株，只测30X，会不会导致测序深度不足。”这个大可不必担心。这里测序如同抽样调查。200个个体，我们抽样测30遍，依然具有群体代表性。就如同计算中国男人的比例，不需要将十几亿人统计一遍，抽样统计部分人群也就足够了。

备注：

[1]case-control，在多种实验涉及中涉及。这里特指重测序中，使用野生型对照个体来消除突变体背景的变异。
[2]BSA，全称Bulk segregant analysis，一种简单粗暴的，通过将群体样本混合，来计算群体基因频率的方法，有明显的优点和缺点。在重测序时代，又有了新的名字：pooling-seq。如果关注，可以阅读Nature review genetics 2014年的综述文章“Sequencing pools of individuals [mdash] mining genome-wide polymorphism data without big funding”。
[3]Abe A, Kosugi S, Yoshida K, et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap[J]. Nature biotechnology, 2012, 30(2): 174-178.