上一次，我们跟大家分享了一下环形RNA的一些基本特征与研究概况
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虽然这类RNA在高等生物中普遍存在，但目前整个生物领域对环形RNA的研究还处于初级阶段。所以，要开展相关研究，首先需要利用高通量测序技术大规模扫描，先将其检测出来进行定性定量，然后才可能开展功能研究。所以今天就和大家分享环形RNA的建库和测序。

一、环形RNA两种建库策略
1）普通的lncRNA建库
这种建库策略大家应该比较熟悉，也就去除样本中的核糖体RNA，然后对线性RNA和环状RNA一起进行测序就可以了
2）环状RNA的特有的建库方法
不仅需要去除样本中的核糖体，而且需要进一步消化样本中的线性RNA

相比之下，我们推荐使用第2种建库策略，环状RNA建库测序的步骤：
环状RNA特有建库策略（如下图）

与普通的lncRNA建库相比，最大的区别是第三步：利用环状RNA可以抵御核酸外切酶降解作用的特点，往样本中加入核酸外切酶，去除线性RNA而仅保留环状RNA。

二、环状RNA测序2种测序策略的优缺点
下面我们从生物信息分析出发， 分析一下两种策略的优缺点，为什么选择第2种策略。

普通lncRNA文库
可以一次性检测样本中的mRNA、lncRNA、环状RNA。

优点体现在：
1）便于比较环状RNA和其他类型RNA的相对丰度；
2）进行共表达分析，分析环状RNA和其他功能已知的RNA（尤其为mRNA）的相互作用关系，从而推测环状RNA的功能。
但普通lncRNA文库测序的缺点也很明显

缺点主要体现在：
1）环状RNA有效数据量低，不易检测到低丰度的环状RNA，因为样本中大部分都是线性RNA；
2）同一基因转录出的线性RNA会干扰环状RNA的检测，从而提高了环状RNA检测的假阳性。尤其下图这种外显子重复串联的线性RNA很容易在分析中与环状RNA混淆。


环状RNA建库
但是它就解决了以上的几个问题：
1）排除了线性RNA的干扰，提高数据可靠性；
2）提高了数据利用率；

可是环状RNA建库也有不足之处：
1)比如建库比常规文库昂贵（越个性化的东西越值钱，你懂得）；
2）一定程度上缺失了样本中的线性RNA信息。如果还关心样本中的线性RNA表达量的话，还需要额外测普通转录组或Qpcr定量。

三、建议数据量
选择好我们采取的建库方法以后，我们需要测多少数据量合适？

首先，环状RNA由于它的检测策略的特殊性，决定了要求较高的数据量：
1）环状RNA一般表达丰度较低，需要较大测序量保证。
（环状RNA建库能够有效富集环状RNA，有利于提高它的丰度）
2）生物信息分析主要通过检测环形结构头尾相连的部分，来判断环状RNA是否存在。而这样的测序片段，也仅仅占环状RNA整条序列数据的一小部分。如果采用普通的lncRNA 文库，比对到环形RNA头尾相连区域相关的reads仅占所有reads的0.1%。

以上两点也是我们不建议普通lncRNA建库策略的原因。

对于数据量的建议，其实是这样的：
环形RNA不仅具有组织特异性，还具有物种特异性。对于环状RNA未报到的物种，测多少数据量合适，属于探索性的问题，需要根据实际项目摸索。但相关的人类研究的报道，还是值得借鉴的。
冷泉港实验室的发表在《RNA》一篇研究（ William R Jeck ，RNA，2013）采用了30G/样本的测序量。而2014年，Nature biotechnology的综述文章（ William R Jeck，Nature biotech.，2014 ）也建议“circRNA analysis requires at least millions of reads, and preferably hundreds of millions, even in libraries with preferential enrichment by RNase R digestion. ”

小结：
如果在实际项目中：
如果使用环状RNA建库的策略-------我们是建议测序量不低于5G/样本，推荐10G/样本以上的测序量。
如果采用普通lncRNA 文库-----------那么我们建议测序量不低于10G/样本，则推荐20G/样本以上的测序量。

对于具体项目，我们到底应该是选择普通lncRNA文库还是环形RNA文库？建议如下：
如果是环形RNA未报到的物种，例如，水稻。--------建议优先采用环形RNA建库的策略，以便对环形RNA有更好的检测效率，发现尽可能多的环形RNA。
如果是环形RNA已报道，且认为目标环形RNA有较高的丰度，同时又特别关心环形RNA与其他线性RNA的相互作用关系。------则可以考虑使用普通lncRNA文库的策略。
当然，最佳策略是两者同时测，相互验证。

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