今天我们分享一篇典型的lncRNA研究文章，这篇文章来自哈佛医学院大牛张毅教授的最新研究成果之一，张毅是全球在表观遗传学领域最为出色的科学家之一，也是研究人类胚胎发育上的权威。

今天解读的这篇文章是研究lncRNA在人类内胚层分化中的作用的。

这篇文章是以lncRNA为主体的文章，文中绝大多数样本只做了2个重复（其中一组样本3个重复），文章中的差异lncRNA的差异用的是1.5倍！但是却发在了《Cell Report》（IF2015：8.358）上。重点是因为这篇文章内容非常丰富，在敲除实验中用了RNA-seq，在基因验证中结合了ChIP-seq，另外后期目标基因验证用了RNA-FISH（RNA荧光原位杂交技术）、qRT-PCR、RNAi、细胞流式实验、IP实验以及FACS等技术，逻辑非常严谨的文章！

这篇文章也是一片典型的lncRNA研究文章：

典型lncRNA研究文章思路

摘 要
长段非编码RNA（IncRNA）可调节多种生物进程，包括细胞系特化。内胚层的定向分化受到许多信号通路和转录因子的控制，但对于lncRNA是否在这一过程中发挥了作用却并不是很清楚。在本文中，他们集中于研究内胚层特有的IncRNA，一种起决定性作用的与内胚层有关的IncRNA1——DEANR1，并证明了它在人类内胚层分化中起到重要作用。他们发现DEANR1通过调节内胚层因子FOXA2表达来促进内胚层分化，更重要的是，过表达FOXA2可以逆转耗尽DEANR1导致的内胚层分化缺陷。机制研究表明，DEANR1通过推动SMAD2/3结合到FOXA2启动子处促进了FOXA2激活。

接下来，我们重点解读一下本文结果部分。

1、内胚层和胰腺细胞谱系


接下来，看一下内胚层和胰腺细胞谱系中lncRNA和蛋白编码基因的表达情况。


与蛋白编码基因相比，lncRNA具有很强的阶段特异性。


从上图可以看到，lncRNA的表达有顺式作用调控：在ESCs, DE, 和PP中lncRNA与其上下游的蛋白编码基因具有很强的共表达相关性。但是在后期分化的胰岛细胞中共表达相关性较弱。

2、DEANR1是人DE阶段特异的LncRNA

在ESCs和DE比较组中有38个差异的lncRNA，其中就包括DEANR1。

I.13个在ESCs中高表达
II.25个在DE中高表达，有12个位于蛋白编码基因的周围，这些蛋白编码基因中包含了内胚层因子GATA6和FOXA2
III.FOXA2相关的lncRNALINC00261（首个DE阶段特异的lncRNA，命名为DEANR1）


如上图所示，DEANR1在DE阶段是高表达的；DEANR1在DE阶段的表达量显著高于其他的细胞类型（NE：分化神经外胚层细胞；EB：分化的胚状体细胞）；同时随着时间逐渐递增的过程。

3、DEANR1对于内胚层分化很重要，并非用于维持胚胎干细胞

shRNA敲除DEANR1之后并不影响胚胎干细胞的维持（SOX2, NANOG，和OCT4等多能性因子并没有发生变化，同时形态学和增长率也不受影响），这也与DEANR1在未分化的ESCs阶段中低表达的结果是一致的。

shRNA敲除DEANR1之后，FOXA2和SOX17内胚层因子的表达量降低。

uRNA-seq的分析结果表明：

Ctrl(敲除的细胞)-VS-KD(敲除DEANR1的细胞)后，632个基因上调；569个基因下调。其中219个DE signature genes；194个ESsignature genes。(FDR< 0.001 and fold change > 2)

4、DEANR1调控FOXA2的表达

收集了47组RNA-seq数据（本研究和其他研究的）计算DEANR1和其他在内胚层分化中其中重要作用的转录因子（MIXL1,SOX17,FOXA2, GSC, EOMES，和GATA6）的表达量相关性，最后我们发现只有FOXA2与DEANR1存在显著的相关性；

FOXA2与DEANR1在基因组位置上是相近的（cis作用）。


在不同的细胞类型中，DEANR1的表达与FOXA2具有很强的相关性。


敲除DEANR1之后，FOXA2的表达量也随之降低。

DEANR1-KnockDown与FOXA2-KnockDown具有很强的相关性，而且它们的基因效应是有重叠的，在两个knockdown细胞中共同上调的基因包含有多能性基因、外胚层和中胚层标记基因；而共同下调的基因包含有内胚层标记基因，这些结果表明knock down DEANR1和FOXA2基因会导致内胚层分化缺失。


导入外源性的FOXA2过表达能够挽救knock down 导致内胚层分化的缺陷；所以FOXA2是DEANR1在内胚层分化过程中主要的调控靶点。

5、DEANR1通过联合SMAD2/3有助于FOXA2的转录
Chip的研究表明SMAD2/3能够结合在FOXA2的启动子区域；

敲除DEANR1能够降低SMAD2/3与FOXA2的结合，但是并不会影响SMAD2/3与另外的一个SMAD2/3的靶基因EOMES结合，这些研究结果表明DEANR1联合SMAD2/3共同调控FOXA2。



小 结
lncRNA由于其具有高度的组织特异性，目前在研究的人类疾病及其他方面的调控非常的热门，同时多重角度的丰富验证实验让文章更具亮点，在本文章中这一点也恰好弥补了2个生物学重复的不足。但是内容十分之丰富，逻辑之严谨，建议做lncRNA研究的老师们可以精读。