约70%的人类基因可以转录，但是只有不到2%是蛋白编码基因（PCGs），可以编码长的蛋白。LncRNA（> 200 bp）作为非编码RNA的重要成员，数量较多，部分已被报道能够调控肿瘤生物学过程，成为很有潜力的癌症治疗靶点。

在哺乳动物中，一些small ncRNAs（约22nt）能够通过相同microRNA反应元件（MRE）同时结合mRNA和lncRNA，这种竞争性吸附miRNA的现象也被称为miRNA sponges， target mimics或者ceRNA（如果都是基因组内源型）。

今天基迪奥为大家解读哈佛医学院的一篇文章，研究者从已有组学数据中综合分析前列腺癌中具有海绵吸附miRNA的lncRNAs（sp-lncRNAs），并通过相关功能实验验证了sp-lncRNAs对经典抑癌基因PTEN的调控作用。

研究背景
尽管一些pseudogenes和lncRNAs被报道具有miRNA sponges功能，关于其在癌症中的广泛性，功能重要性和相关靶基因的系统研究还很少。

研究思路
通过分析前例腺癌中lncRNA和mRNA的序列特征和表达谱，构建sp-lncRNA、miRNA和PCGs的网络互作关系图。再选择调控miRNA-PTEN相关的sp-lncRNA进行功能学验证。具体如下（图1）：

图1. 生物信息分析前列腺癌中lncRNA-miRNA-mRNA相互关系的流程图

1、下载GEO（GSE21034和GSE46691）中前例腺癌（原发和转移）的表达谱和exon芯片数据，通过Ensembl database和RNA-seq data进行lncRNA注释，得到11,271个lncRNAs，再利用CPAT软件计算编码能力，最后筛选到10,640 lncRNAs。

2、通过挑选保守家族和前例腺细胞系DU145表达top 50%的miRNA作为海绵吸附miRNA候选pool；再利用TargetScan软件预测候选miRNA的靶向lncRNAs和PCGs。

3、从已发表Vogelstein et al.数据中选择原发和转移前例腺癌显著差异表达的45个候选癌症驱动PTGs。

4、利用上述候选数据预测海绵吸附miRNA的lncRNAs（sp-lncRNAs）。

首先，根据是否具有相同MRE和表达相关性，筛选lncRNA-miRNA-mRNA的gene pairs；
其次，筛选gene pairs中至少有10个以上共享的miRNAs，以及至少8个以上唯一的共享miRNAs位点；
最后，再考虑两个独立的clinical cohorts （MSKCC和Mayo clinic）一定的相关性（r > 0.25）的gene pairs。

5、选择调控抑癌基因PTEN相关的sp-lncRNAs进行功能学验证。

研究结果
1.通过综合的生物信息学分析流程，预测lncRNA-miRNA-mRNA相互关系并构建一个网络。总共包括52个sp-lncRNAs和17个PCGs的96条调控关系。圈图中每个node表示相对独立的基因，每个edge代表sp-lncRNA-PCGs间的调控关系（图2）。

图2. sp-lncRNA-PCGs间的调控关系圈图

2.部分PCGs如PTEN和MLL2具有更多的sp-lncRNAs，暗示这些基因收到海绵调控的作用更强。网络中的PCGs至少与一个预测sp-lncRNAs相关，同时sp-lncRNAs能够调控许多PCGs，预示癌症中这种组合型调控关系（combinatorial regulation）的存在（表1）。

3.作者选择sp-lncRNAs数量较多的PTEN进行功能学验证，在8个PTEN相关sp-lncRNAs中筛选sp-lncRNAs lnc-2（CTB-89H12.4, ENSG00000230551）和lnc-6 （Taurine Upregulated Gene 1 (TUG1), ENSG00000253352）；其中在MSKCC和Mayo Clinic群体中Lnc-2，lnc-6的表达一直与PTEN呈正相关状态。作者还检测了另一个sp-lncRNA lnc-7，发现其与PTEN的表达在不太的全体中相关性也不同（图3）。Lnc-2，lnc-7与PTEN表达一致性符合lncRNA-miRNA-mRNA表达的特点。

图3. sp-lncRNA lnc-2, lnc-6, lnc-7在MSKCC和Mayo Clinic群体中与PTEN表达的相关性

4.作者利用siRNA分别敲低lnc-2，lnc-6和lnc-7，通过western blot和luciferase-PTEN-3’UTR reporter实验，结果显示干扰lnc-2和lnc-6后DU145中PTEN的表达量显著降低（图4）。

图4. lnc-2，lnc-6敲低后PTEN表达显著下降

5.RT-PCR和Anti-Ago2-RIP-ChIP结果显示lnc-2，lnc-6主要分布在细胞质中，而lnc-7在细胞质中的表达量较低（图5）。由于miRNA抑制作用主要发生在细胞质中，预示着lnc-2和lnc-6更容易通过吸附miRNA调控PTEN。

图5. Lnc-2，lnc-6和lnc-7在细胞中的表达分布

6.在细胞系DU145和HCT116中进行细胞增殖实验，敲低Lnc-2和lnc-6，与敲低PTEN具有相同的作用，都可以显著加快癌症细胞的增殖。

图6. DU145，HCT116细胞增殖实验

总    结
通过分析癌症中lncRNA和mRNA的组学数据，作者构建了lncRNA-miRNA-mRNA的调控网络，揭示了lncRNA通过海绵吸附miRNA来调控癌症驱动基因的作用具有一定的广泛性。

作者通过多种标准来进行数据筛选，如选取原发和转移型前列腺癌显著差异的45个癌症相关基因作为候选PTGs，选取保守和表达量高的miRNA来预测靶向lncRNA和mRNA等，这些方法都有助于缩小筛选范围，精确找到与前列腺癌最相关的调控网络。

最后，作者选取了预测网络中经典的癌症抑制基因PTEN作为候选进行功能学验证，多种角度展示了lnc-2，lnc-6 miRNA依赖型调控PTEN的作用关系，以及lnc-2，lnc-6对癌症细胞增值的重要作用，为医学研究提供分子机理。

参考文献
【1】Du, Z., et al. (2016). Integrative analyses reveal a long noncoding RNA-mediated sponge regulatory network in prostate cancer. Nature Communications 7: 10982.

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