今年7月，山东农业大学张宪省教授在《Plant Physiology》杂志发表了一篇题为“Thioredoxin-mediated ROS Homeostasis Explains Natural Variation in Plant Regeneration”的文章，阐明了影响拟南芥再生能力自然变异的分子机制，基迪奥有幸参与该项目，配合完成了拟南芥野生型和突变体的转录组测序及生物信息学分析，筛选了影响芽再生的关键基因与信号通路。

合作单位：山东农业大学张宪省教授          发表杂志：《Plant Physiology》         影响因子：6.456

研究背景
植物再生对基因研究和农业应用是必需的，植物的再生能力在不同基因型中变化很大，但是造成这种变化的机制目前还没有被阐明。活性氧（ROS）是关键的信号分子，可以通过氧化翻译后修饰改变靶标蛋白活性，这些靶标蛋白参与激素信号感知与响应、MAPK信号转导等。

在根生长过程中，ROS内稳态对于细胞增殖到细胞分化的转变是至关重要的，而ROS内稳态被多种抗氧化因子调控，硫氧还蛋白（Trxs）就是清除ROS的关键因子。线粒体呼吸复合物I（the mitochondrial respiratory complex I，Complex I）亚基的氧化还原状态影响复合物的活性，碳酸酐酶2（CARBONIC ANHYDRASE 2, CA2）和另四个碳酸酐酶组成了一个Complex I功能性亚基，而Complex I的很多亚基是Trxs的潜在靶标。

实验材料与方法
对野生型拟南芥（Col-0-A, Col-0-B, Col-0-C）和硫氧还蛋白DCC1突变型拟南芥dcc1 （dcc1-A, dcc1-B, dcc1-C）进行RNA-seq分析，寻找芽再生关键基因。

对48个不同生态型拟南芥中的DCC1核酸序列进行连锁不平衡分析，寻找与芽再生相关的SNP位点。

研究思路

研究结果
1、DCC1突变抑制拟南芥芽再生能力
为了确定Trxs 在芽再生中的功能，利用T-DNA 插入突变，发现七种Trxs中只有AT5G50100 显著影响了芽再生，命名为DDC1。DCC1突变下调拟南芥的芽再生能力，包括低的芽分化频率和愈伤组织芽数量，而恢复突变后可以恢复表型（图1）。原位杂交和beta-GUS分析结果显示，在芽再生过程中，DCC1主要在愈伤组织内部区域表达。

图1  DCC1突变影响芽再生能力

2、DCC1 编码功能性硫氧还蛋白
DCC1在功能未知的DUF393结构域的N端包含一个DxxCxxC基序（图2A），DxxCxxC基序在不同物种的DCC家族蛋白中具有序列保守性（图2B），进化分析结果显示DCC1和其他物种的蛋白均有高度同源性，如亚麻芥（Camelina sativa）、芜菁（Brassica rapa）和萝卜（Raphanus sativus）（图2C）。

两个半胱氨酸残基暗示DCC1调控二硫键交换，FiTC-insulin对Trx活性高度敏感，二硫键减少后显示更高的荧光表达，分析结果显示DCC1蛋白孵育后具有很高的荧光密度（图2D），表明DCC1作为Trx行使功能，并且发现其定位在线粒体（图2E）。

图2  DCC1 编码功能性硫氧还蛋白

3、DCC1或CA2突变显著下调Complex I的活性，上调ROS水平
酵母双杂试验、pull down、荧光素酶互补图像检测和DCC1-GFP免疫共沉淀试验表明DCC1和CA2存在直接相互作用（图3）。CA2突变显著下调芽再生能力，包括低的芽分化频率和愈伤组织的芽数量，而恢复突变后可以恢复表型。

DCC1或CA2突变显著下调Complex I的活性，同时突变DCC1、 CA2与单个突变没有更明显变化（图4A），表明这两种蛋白在相同的通路上起作用，且双突变的complex I活性可以被同时过表达DCC1和CA2蛋白完全回复（图4B）。利用DAB染色分析检测愈伤组织ROS水平发现，在芽再生过程中，DCC1或CA2突变上调愈伤组织ROS水平（图4C）。

图3 DCC1与CA2直接相互作用

图4 DCC1或CA2突变影响线粒体呼吸复合物I的活性和ROS水平

4、ROS水平影响芽再生能力
H2O2能上调ROS水平，利用H2O2处理野生型外植体发现，H2O2抑制芽再生能力，并且浓度越高，抑制效果越显著（图5）。谷胱甘肽（GSH）是主要的内源清除ROS的抗氧化因子，DCC1、CA2突变后，GSH处理组相比未处理组，芽再生能力显著上调（图6）。过氧化氢酶3（CATALASE 3，CAT3）编码蛋白催化H2O2水解生成H2O和O2，过表达CAT3上调芽再生能力，过表达CAT3引起的ROS下调可以恢复突变的表型（图6），表明ROS水平对调节芽再生能力是至关重要的。

图5  ROS水平影响芽再生能力

图6  GSH和CAT3对芽再生的影响

5、ROS 通过调控多种信号通路影响芽再生
野生型拟南芥和DCC1突变型拟南芥RNA-seq分析结果发现，在突变组中，689个基因显著上调，2332个基因显著下调（图7A）。GO富集分析显示DCC1调控多种生物学过程，比如生物素合成过程、芽系统发生、氧化还原过程、细胞分化及器官形态发生等（图7B）。

除了WUS和STM，分生组织主效基因KNAT1、KNAT2、KNAT4、WOXs、CUCs在DCC1突变体中也显著下调（图7C）。qRT-PCR结果验证了这些基因的转录水平，表明DCC1介导的ROS水平通过影响芽分生组织形成相关基因调控芽再生。

七个生物素合成基因和生物素响应基因在DCC1突变体中显著下调，利用已知的生物素标记分子DR5rev:GFP检测在芽再生过程中生物素响应信号分配，发现H2O2处理后GFP信号减弱，ROS抑制生物素信号，表明ROS至少有一部分是通过调控生物素合成信号通路影响芽再生。

图7  野生型拟南芥和DCC1突变型拟南芥RNA-seq分析

6、DCC1 在拟南芥芽再生的自然变异中扮演重要角色
利用48个不同生态型中的DCC1核酸序列进行连锁不平衡分析，发现了六个SNPs （SNP 108、147、174、 175、378和 481）和芽再生频率高度相关，两个单倍型（Hap1和Hap2）确定了48个拟南芥的自然变异，Hap1包含30个生态型，Hap2包含18个生态型（图8A、B、C），Hap1生态型的芽再生频率和单个愈伤组织的芽数量高于Hap2生态型（图8D、E）。

六个SNPs中只有两个（SNP175和481）造成有义突变，175和481位点的突变没有影响DCC1的硫氧还蛋白活性（图8F、G），但是两个位点突变时DCC1和CA2没有相互作用，无法回复芽再生能力（图8H、I），表明DCC1的SNP175和SNP481对芽再生是关键的。

利用DAB染色检测Hap1和Hap2生态型的ROS水平发现，Hap2生态型的ROS水平显著高于Hap1，但芽再生能力低于Hap1（图9），表明DCC1介导的ROS体内稳态平衡对于拟南芥芽再生的自然变异是至关重要的。

图8  DCC1调控不同生态型拟南芥芽再生能力

图9 不同生态型拟南芥的ROS水平与芽再生能力

总  结
DCC1氧化还原重塑CA2蛋白，调控Complex I活性，DCC1或CA2突变导致Complex I活性下调，产生ROS，ROS的上调抑制多个通路的基因表达，从而抑制芽再生。

该研究逻辑思路严谨，实验验证充分，揭示了硫氧还蛋白通过氧化还原重塑调控ROS内稳态，进而影响芽再生过程，这为理解植株再生的自然变异机制提供了新的证据。

参考文献
【1】Zhang H, Zhang T T, Liu H, et al. Thioredoxin-Mediated ROS Homeostasis Explains Natural Variation in Plant Regeneration.[J]. Plant Physiology, 2017:pp.00633.2017.

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