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基迪奥客户合作文章:转录组致癌基因Etv5对mESC分化的调控机制研究



合作单位:西北农林科技大学            发表期刊:Cell Death & Disease                   影响因子:  5.965
关键词:多能干细胞、转录因子、RNA-seq分析、重编程机制

体外过表达已确定一些转录因子(TF)可以将体细胞重编程为多能状态。相比之下,单能精原干细胞(Unipotent spermatogonial stem cells,SSCs)内源性表达多能性TF(包括Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28),仅通过控制培养条件,就能够有效地重新编程为多能干细胞,表明参与SSCs自我更新的TF可能有助于细胞重编程,以获得多能性。然而,目前尚未系统地研究过SSCs自我更新TFs在体细胞重编程中的作用。

实验设计
1)   利用MEF(小鼠成纤维细胞)诱导生成iPSC(诱导多能干细胞);
2)   利用小鼠胚胎干细胞(mESCs)进行RNA-seq,包括Etv5-KDmESCs (Ets (E-twenty-six) variant gene 5敲低)组和Tet2–KD mESCs组。


研究思路

结果解读
1、Etv5增强体细胞重编程
通过检索、构建转录因子pool,筛选SSCs特异性TFs,并研究这些TFs在促进iPSCs效率方面的作用。结合OSKM(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc),发现4个SSCsTFs(Bcl6b、Lhx1、Foxo1和Plzf)降低了iPSC诱导效率,3个SSCsTFs(Id4、Taf4b和ETV5)增加iPSC诱导效率。其中,ETV5表现出最高效率。


图1 ETV5促进诱导多能干细胞产生效率

2、Etv5通过Tet2-miR200s-Zeb1促进重编程
为了研究Etv5促进重编程的机制,作者从两个方面入手:1)细胞增殖;2)MET(mesenchymal–epithelial transition)。结合细胞的生长曲线、免疫荧光和流式细胞术等实验,发现Etv5显著降低细胞增殖,并且内源性Etv5-KD上调间充质TF-Zeb1 的表达。
通过VISTA(基因组在线比较工具)分析发现,miR-200s家族(能与Zeb家族相互作用)启动子区域没有Etv5潜在结合位点,但可以与Tet2(Tet蛋白直接调控miR-200s家族)结合调控其表达。以上研究结果表明,Etv5可通过Tet2-miR200s-Zeb1调控机制促进MET。


图2  Etv5调控MET机制示意图

3、敲低Etv5引起mESC转录组变化
接下来作者研究了Etv5在mESCs中的作用,RNA-seq结果显示,敲低Etv5引起1049个基因显著差异表达,GO富集分析结果显示这些基因显著富集在血管再生和MAPK信号通路等GO terms中;而敲低Tet2只有477个显著差异表达基因,这些基因显著富集在伤口修复、血液凝固等生物学过程。

通过Etv5 -KD RNA-seq和Tet2 -KD RNA-seq比较分析发现,12个共有基因呈现上调表达,15个呈现下调,并且GO terms部分重叠,表明Etv5和Tet2在调节mESC分化中具有重叠功能,这些差异表达基因是Etv5-Tet2调控轴的下游靶标。


图3  mESCs Etv5-KD和Tet2-KD RNA-seq差异表达分析

4、Etv5调节原始内胚层和外胚层
在15个共有下调基因中,Gata6和Pdgfra被认为调节原始内胚层分化,因此通过qPCR进行验证。研究结果显示,在mESCs分化过程中,Etv5-Tet2-Gata6调控轴正向调节原始内胚层分化,而Etv5负向调节外胚层分化。


图4  Etv5调控原始内胚层和外胚层分化分子机制示意图

5、研究小结
本文阐明了致癌基因Etv5对体细胞重编程、mESC维持和分化的调控机制,主要是通过联系已知研究结果,辅助转录组测序结果和公共数据库,层层递进,逐步筛选下游作用分子,最终寻找到两条分子调控机制。整个分析过程思路很清晰,对如何挖掘分子机制有很好的借鉴意义。

基迪奥完成了小鼠转录组链特异性建库测序和生物信息分析,确定了两个目标基因引起的基因表达变化情况及显著富集的GO terms,并通过比较分析筛选了共同作用靶标,为阐明目标基因的作用机制奠定了基础。

参考文献
Zhang J, Cao H, Xie J, et al. The oncogene Etv5 promotes METin somatic reprogramming and orchestrates epiblast/primitive endodermspecification during mESCs differentiation[J]. Cell death & disease, 2018,9(2): 224

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