转录组是指某个物种特定细胞或组织在某一状态下所转录出来产生的所有转录本的集合。对真核有参生物进行转录组测序,既可定量测定每个转录本在生长过程中和不同的条件下的表达水平的变化,还可以对基因结构进行分析,研究SNP、可变剪切、基因结构优化等信息。通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或者器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

 
 
应用领域
1. 基因表达水平研究
2. 基因结构水平研究

 

 技术路线

 

 

分析内容

 

基础分析
1. 测序质量评估与原始数据过滤,去除接头序列及低质量reads
2. 比对参考基因组或参考基因序列
3. 测序与比对评估(数据比对统计,测序饱和度分析,测序随机性分析)
4. 基因表达统计(基因覆盖度,表达量,表达量丰度分布)
5. 新基因的转录本预测及注释(需有参考基因组,限动植物)
6. 样本关系分析(主成分分析(PCA)、相关性检验、样本聚类图)
7. 差异表达基因分析(两个或两个以上样品)
7.1 差异表达基因筛选
7.2 差异基因火山图
7.3 差异基因表达模式聚类分析(热图)
7.4 差异基因GO功能显著性富集分析
7.5 差异基因Pathway显著性富集分析
7.6 差异基因Reactome显著性富集分析(限部分物种)
7.7 差异基因DO显著性富集分析(限人)互作网络分析
7.8 GSEA分析(GO/KEGG/Reactome/DO)
8. omicmart 在线报告

高级信息分析1.  SNP分析

2. 基因结构优化
3. 基因可变剪切鉴定
4. 趋势分析
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

 

 

 

样本要求

样品需求:总量≥5μg,浓度≥ 100 ng/μl
样品纯度:动物样品, RIN ≥8, OD260/280≥1.8,28S/18S≥1.0;
样品请置于1.5 ml管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管,干冰运输。

 

 

 

项目周期

标准流程完成时间为35个工作日

 

 

参考文献

[1] Liu C H, Liu Y, Shao X H, et al. Comparative Analyses of the Transcriptome and Proteome of Comte de Paris and Smooth Cayenne to Improve the Understanding of Ethephon-Induced Floral Transition in Pineapple[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 50(6): 2139-2156.
[2] Yuan K, Xie X, Wang X, et al. Transcriptional response of Mycobacterium sp. strain A1-PYR to multiple polycyclic aromatic hydrocarbon contaminations[J]. Environmental Pollution, 2018, 243: 824-832.
[3] Zheng T, Qi P F, Cao Y L, et al. Mechanisms of wheat (Triticum aestivum) grain storage proteins in response to nitrogen application and its impacts on processing quality[J]. Scientific reports, 2018, 8(1): 11928.
[4] Guo J, Qi J, He K, et al. The Asian corn borer Ostrinia furnacalis feeding increases the direct and indirect defense of mid‐whorl stage commercial maize in the field[J]. Plant biotechnology journal, 2018.
[5] Li N, Yang L, Qi X K, et al. BET bromodomain inhibitor JQ1 preferentially suppresses EBV-positive nasopharyngeal carcinoma cells partially through repressing c-Myc[J]. Cell death & disease, 2018, 9(7): 761.
 
 

 

 

 

 

 

Q1转录组测序需要多少数据量?

A:这个因研究的物种和研究需求而异。常规的动植物物种我们一般推荐6G数据量,基因组比较小的原核生物或真菌推荐可测3G。而对于部分基因数目较多的物种、老师关注的基因表达丰度较低的项目、病原宿主互作项目,可根据情况适当增加数据量。

 

 

Q2有参比对到基因组还是转录本?

A:有参物种有两种选择:

1)比对基因组;

2)比对到转录本,理论上这两种选择的分析结果应该是大同小异的。

 

Q3对于参考基因组不好的情况下,选择无参还是有参?

A:只要有参考基因组,优先推荐使用参考基因组来做分析。对于基因组拼接来说比较难的部分是重复区,基因组装质量不好主要是因为重复序列。基因组编码区的序列无论是杂合率或重复性都比较好,所以相对容易拼接。编码区的组装质量一般较好。所以优先使用参考基因组。

 

 

Q4转录组找snp 或者编辑位点要去RNA 冗余吗?

A:不需要。重测序的话,的确需要去除PCR导致的冗余。但RNA-seq产生的read 冗余,可能是真实的冗余。这是因为RNA-seq的测序深度大大高于重测序。RNA-seq call SNP要解决的问题主要不是reads 冗余,其主要有2个问题会影响SNP 准确性:

1)基因编辑,基因编辑的存在会导致很多SNP变异并不是DNA层面的,而是转录过程中修饰导致新的碱基,

2)RNA-seq存在大量可变剪切,容易导致比对错误而产生很多大量假阳性SNP。如果RNA-seq要call SNP,需要把内含子及外显子边界周围(例如5bp以内)的SNP去除掉,因为这些区域的SNP假阳性比较高。

 

 

 

 

 

 

 

 

转录组分析研究杂交水稻杂交不育的机制

合作单位:华南农业大学

发表期刊:Nature Communications

影响因子:12.35

 

研究背景

杂种不育(HS)是合子后生殖隔离的主要机制之一。S1是一个典型的单位点HS基因座,可以影响非洲和亚洲水稻杂交后代。在这些亚非水稻杂交种中,携带亚洲水稻S1等位基因(S1-s)的雄配子和雌配子败育,导致非洲水稻S1等位基因(S1-g)具有很强的优先传导性。在S1-g处的S1TPR基因是介导S1 HS所必需的基因。S1TP(S1-s处)是S1TPR的等位基因,由于单核苷酸突变使S1TP过早终止,从而长度短于S1TPR。除了S1TPR外,S1-g区域还含有6个非洲水稻特异性基因S1A1-S1A6,其中S1A2-S1A6在花药和幼穗中具有转录活性。

 

实验方法

在不同时期,对近等基因系(NIL-g)、轮回亲本(RP-s)及其F1植株的花药,共6个样本进行转录组测序。

 

研究思路

图1:研究思路

 

研究结果

特异性S1组分S1A4和S1A6对HS的影响

为了研究S1A2-S1A6是否参与了S1 HS,作者使用CRISPR/Cas9在NIL-g(携带S1-g的近等基因系)中分别对S1A2-S1A6进行了敲除。结果显示,当这些突变体与RP-s杂交时,含有s1a2、s1a3或s1a5的突变F1植株是半不育的(约50%不育花粉粒和小穗);而含有s1a4和s1a6等位基因的突变F1植株完全可育。结果说明S1A4和S1A6是引起S1位点HS的影响因子之一。

S1A4-S1TPR-S1A6构成的杀死-保护模型

确定S1A4和S1A6是影响亚非水稻杂交不育的基因,作者为了研究S1A4、S1TPR和S1A6三基因组合是否可以使配子败育,作者用包含这三种基因的不同组合模式对RP-s进行了转基因转化。所有经过单基因(S1TPRt、S1A4t或S1A6t)或双基因(S1A4-S1A6t、S1TPR-S1A6t或S1A4t-S1TPRt)半合子状态转化的植株,均未表现出花粉和小穗半不育的表型(图2b、c)。而在纯合S1A4-S1A6t和S1TPRt系杂交将三个转基因组合在一起时,F1转基因植株的花粉和小穗是半不育的(图2d)。该结果表明,S1A4、S1TPR和S1A6构成一个杀死系统。

图2 转基因植株的育性研究

图3 S1TPRt与NIL-g杂交产生的F1和F2植株的育性

作者将S1TPRt与NIL-g杂交产生F1(S1-gS1-s/S1TPRt-)单株,该F1在孢子体组织中含有S1-g等位基因(因此应该激活HS),但在配子中会分离出S1TPRt。结果显示,S1位点杂合且缺少S1TPRt基因的F1和F2植株是半不育的。相反的携带S1TPRt基因,在S1位点杂合的F1和F2植株的花粉和小穗的受精率提高到约75%。并且,纯合S1TPRt的S1杂合子完全可育,表明S1TPRt允许携带该基因的S1-s等位基因的存在(图3)。这表明S1TPRt确实以配子体的方式保护了含有S1-s的配子。

 

基于以上的结果,作者提出了S1A4-S1TPR-S1A6杀死-保护模型。在S1TPRt×NIL-g的F1植株(S1-gS1-s/S1TPRt)中,S1-g等位基因在孢子体细胞中产生不育信号。由于内源性S1TPR的存在,保护所有含S1-g的配子,使其都存活了下来;但是S1-s的配子除非携带S1TPRt基因,否则都会败育。

S1 HS系统的转录组分析

为了确定导致配子败育生化过程有哪些,探索其发生的机制,作者对RP-s、NIL-g及其F1杂交后代的花药(小孢子母细胞期到减数分裂期)进行了转录组测序。NIL-g和F1与RP-s相比,包含250个上调基因和74个下调基因(图4a)。

对这些基因进行KEGG富集分析,结果显示参与光合作用和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸(支链氨基酸,BCAA)降解的基因表达水平在NIL-g和F1植株中明显高于RP-s植株(图4b)。进一步利用qRT-PCR进一步验证了这些参与光合作用和BCAA降解的差异基因表达谱。该结果表明,光合作用和BCAA可能与配子发育有关。

 

 

图4 不同基因型花药的转录组分析和KEGG富集分析

图5 BCAA降解相关基因的表达分析

S1配子杀死-保护系统的进化模型

为了研究S1位点的进化,作者使用S1TPR、S1TP、S1A4和S1A6核苷酸编码序列,利用GenBank数据库对禾本科植物序列中同源的序列进行BLAST搜索,并构建了候选基因的系统发育树(图6)。下一步,作者对AA染色体和非AA染色体水稻基因组中进行S1TPR、S1TP、S1A4和S1A6序列的鉴定。

发现澳大利亚野生稻中存在S1A4-S1TP、S1A6-S1TP或S1TP结构;在非洲野生稻(非洲稻的祖先)中存在S1A4-S1TPR、S1A6- S1TPR或S1TPR结构。因此作者推测,包含S1TP和侧翼基因S1A4和/或S1A6(S1A4-S1TP,S1TP-S1A6,S1A4-S1TP-S1A6)可能首先在澳大利亚野生稻中出现,然后出现携带S1TPR的双基因中间结构(S1A4-S1TPR和S1TPR-S1A6)和最终出现功能性S1A4-S1TPR-S1A6复合体。

图6 S1位点S1TPR(TPR)同源基因的系统发育树

 

参考文献

Y. Xie, J. Tang, X. Xie, X. Li, J. Huang, et al., An asymmetric allelic interaction drives allele 1437 transmission bias in interspecific rice hybrids. Nature Communications 10(1):2501 (2019).